一、实验耗材与试剂配制1. 实验材料SPF 级小鼠推荐新生 1–3 日乳鼠细胞活力、纯度最优成年小鼠亦可细胞增殖偏弱、超净工作台、CO₂培养箱、体视显微镜、恒温水浴锅、低温离心机、70 μm 细胞筛、培养皿、离心管、显微解剖器械套装2. 试剂配方预冷无菌 PBS含双抗PBS 粉剂配制添加 100 U/mL 青霉素 100 μg/mL 链霉素4℃预冷备用混合消化液0.25% 胰蛋白酶 0.1% Ⅱ 型胶原酶无血清 DMEM 稀释现配现用完全培养基DMEM/F12 基础培养基 10% 胎牛血清 (FBS) 1% 青链霉素双抗裂解试剂TrizolRNA 提取、RIPA 裂解液 蛋白酶抑制剂蛋白提取二、组织取材步骤全程冰上低温操作抑制细胞凋亡乳鼠脱颈处死全身浸泡 75% 医用乙醇消毒 15 s移入超净台俯卧固定小鼠沿脊柱中线剪开背部皮肤与肌肉暴露脊柱体视显微镜下剪开椎管逐节取出两侧背根神经节DRG收集所有 DRG 置于预冷含双抗 PBS 中精细剔除外周神经纤维、结缔组织包膜、血管杂质PBS 漂洗 2 次彻底去除血液残留无菌眼科剪将 DRG 剪碎至 1 mm³ 细小组织团块。三、组织酶解消化将剪碎 DRG 组织移入 15 mL 离心管加入 3–5 mL 混合消化液浸没组织置于 37℃恒温水浴锅消化 35 min每 10 min 轻柔吹打 3–5 次打散组织团消化终点判断组织呈絮状松散状态即刻加入等体积完全培养基终止胰酶消化细胞悬液经 70 μm 无菌细胞筛过滤去除未消化组织残渣。四、离心富集与差速贴壁纯化去除神经元核心步骤过滤后细胞悬液1000 rpm室温离心 5 min小心弃去上清沉淀用 2 mL 完全培养基轻柔重悬充分吹散细胞团将细胞悬液接种至细胞培养皿放入 37℃、5% CO₂培养箱静置45 min 原理卫星胶质细胞贴壁速度快大体积神经元悬浮于上清中几乎不贴壁缓慢吸取上层含神经元的悬浮上清丢弃沿皿壁缓慢加入新鲜完全培养基若需极高纯度可重复一次差速贴壁流程大幅降低神经元污染率。五、细胞常规培养培养环境37 ℃、5% CO₂、饱和湿度恒温培养箱接种后 24 h 首次全量换液清除细胞碎片、凋亡杂质后续每 2~3 天更换一次完全培养基细胞生长状态3~4 天汇合度可达 80%~85%图.武汉云克隆小鼠卫星胶质细胞(SGC)原代细胞白光形态图x100使用建议卫星胶质细胞增殖能力有限优先选用 P1、P2 代细胞开展功能实验传代过多会出现细胞老化、表型丢失。六、细胞传代操作弃旧培养基预冷 PBS 漂洗细胞 1 次加入 0.25% 胰蛋白酶室温消化 2~3 min显微镜下观察细胞皱缩变圆立刻加入完全培养基终止消化轻柔吹打皿底制成单细胞悬液离心、重悬后按 1:2 比例分皿接种培养。七、细胞纯度鉴定免疫荧光法标志物判定 卫星胶质细胞阳性标记GFAP图.武汉云克隆小鼠卫星胶质细胞(SGC)原代细胞免疫荧光鉴定图GFAP抗体x200阴性对照NeuN神经元标志物用于排查神经元污染合格标准GFAP 阳性细胞占比≥90%八、关键注意事项 常见问题规避取材全程低温DRG 离体后极易受损冰上操作缩短时长消化时间不可过长过度消化会破坏细胞膜大幅降低细胞活率差速贴壁时间严格把控过短纯度不足过长胶质细胞损耗过多成年小鼠 SGC 活性偏低衰老更快药物、机制实验首选新生乳鼠取材。