多因子检测技术因其“一次实验多重数据”的高效性正迅速成为生命科学研究的热门工具。然而许多研究者尤其是首次接触的用户在试剂盒选择、实验操作和数据分析等环节常常面临诸多困惑。基于我们与大量用户的深入沟通本文将我们最常被问及的核心技术问题、操作疑难及解决方案整理了出来。无论您是正在为选购试剂盒做前期调研还是实验过程中遇到了瓶颈希望这份FAQ对您的研究能有所帮助。一、两类多因子检测试剂盒该如何选云克隆有配套Luminex磁珠和配套CBACytometric Bead Array微球的试剂盒客户可以根据实验室仪器类型来选择合适的试剂盒。Luminex法的多因子试剂盒适用仪器Luminex MAGPIX®、Luminex 100/200™、FLEXMAP 3D、xMAP INTELLIFLEX®、Bio-Rad® Bio-Plex®建议仪器使用前提前预热并做好自检和校准。CBA法的多因子试剂盒适用仪器NovoCyte D2060R、Navios、FACSMelody、Gallios、DxFLEX、CytoFLEX S等建议仪器使用前提前预热并做好自检和校准。流式细胞仪仅需要APCPE双通道就可以同时检测27个靶标27个以上靶标需要用到APC、APC-Cy7、PE三个通道。图1 云克隆Luminex xMAP和流式CBA两大检测平台二、多个靶标是否可以用一个试剂盒同时进行检测需要根据靶标的方法学适用性、稀释倍数匹配度及交叉反应验证结果综合评估是否适合进行组合检测。若所有待测靶标均适用双抗夹心法或均适用竞争抑制法则理论上可组合至同一试剂盒中进行检测。在云克隆试剂盒的检测体系中若同一样本类型下各靶标所推荐的稀释倍数差异较小则可考虑组合至同一试剂盒反之若稀释倍数差异过大则通常不建议进行组合。若不同靶标之间的序列或结构相似度较高且经实验验证存在交叉反应则此类靶标不适宜组合至同一试剂盒中以避免相互干扰导致检测结果失真。三、多因子检测试剂盒的保存和有效期。1. 多因子检测试剂盒该如何保存未开封的试剂盒是否可以整个放在-20度进行保存未开封的试剂盒所有试剂均按试剂瓶标签上所示保存。收到试剂盒后请尽快将标准品、标准品稀释液、检测溶液A、检测稀释液A保存于-20度其余试剂请置于4度保存备用。预混合磁珠和检测溶液B需避光保存。请注意未开封的试剂盒不能整个放在-20度进行保存因为磁珠和检测溶液B不建议-20度保存,会影响试剂的性能。使用后的试剂盒剩余试剂仍需按照试剂瓶标签所示的温度保存。2. 多因子检测试剂盒的有效期是多久有效期为1年。四、多因子检测试剂盒中检测试剂相关问题1. 试剂盒试剂中是否含有乙醇或其他表面活性剂试剂盒试剂不含有乙醇或其他表面活性剂。2. Luminex中磁性微球是什么材质磁性微球核心是氧化铁覆盖有羧基材料和其他塑料成分。磁性微球用荧光染色法进行编码通过调节两种荧光染料的不同配比来获得多达100种不同的磁性微球。3. 基于Luminex的多因子试剂盒中的磁性微球和其他公司的luminex磁性微球是否通用基于luminex方法的多因子试剂盒中的luminex磁性微球与其他公司的luminex磁性微球是一样的但由于偶联技术及实验所使用的抗体对的差异不建议不同试剂盒的微球和试剂混用。五、多因子检测试剂盒检测样本相关问题1. 多因子检测试剂盒适用的样本类型包括哪些常见样本类型血清、血浆、组织匀浆液、细胞裂解液、细胞培养上清和其它生物液体(脑脊液、肺泡灌洗液、唾液等)。有些客户的样本类型为全血样本这类样本不适用于Luminex磁珠因为实验过程中微球容易丢失。但可以尝试用流式细胞仪检测适配的大颗粒微球。一盒多因子检测试剂盒能测多少例样本一个试剂盒有96 test每组标曲使用7 test。所以有89孔可用于样本检测。而实验是否安排预实验和复孔会进一步改变可检测的样本数量。3.需要的样本量是多少双抗夹心法检测试剂盒每孔需要上样100μL竞争抑制法检测试剂盒每孔需要上样50μL。云克隆多因子检测试剂盒通常建议对样本进行至少2倍稀释后上样因此实际所需样本量相应减半双抗夹心法每孔最多需样本50μL竞争抑制法每孔最多需样本25μL。不同试剂盒推荐的样本稀释倍数不同所以需要的样本量也会随之变化。六、其他常见问题1. 标准品和样本是否需要做复孔主要取决于客户的选择。多因子检测试剂盒的检测每个样本孔单个靶标会测定50-100个微球的信号取中位值所以在检测准确性和客观性上是很好的一般无需设置复孔但客户如关心偶然的操作误差也可以考虑对标准品和样本设置复孔。2. 多因子检测试剂盒检测范围和灵敏度。多因子检测试剂盒分为单因子和多因子试剂盒。单因子试剂盒检测范围和灵敏度可参考官网产品页面信息。多因子试剂盒属于定制产品需要制备后才有准确信息。而根据经验多因子试剂盒的检测范围大多数和单因子的一样。如果客户对于检测范围和灵敏度有要求我们可以在研发中进行调整请订购前和我们沟通。3. 多因子试剂盒各种性能如何验证稳定性37℃破坏性实验。批次差异出货前我们会安排验证确保批内差和批间差都小于10%。特异性单因子试剂盒会验证结构和功能类似物多因子试剂盒会验证组合间的各因子间是否存在干扰。4. 客户收集的是临床样本每次收样后需要立即检测。如果客户每次的样本只有5-7例客户想要分多次做实验可以订购时加订标准品吗是不是在效期内做多次实验不会影响检测结果呢可以加订标准品在效期内做多次实验不会影响检测结果。5. 结果分析——标曲拟合和样本测算方法常用的拟合方式有两种1浓度和MFI取双对数后二次函数拟合2浓度和MFI取双对数后四参数拟合。6. 实验中发现磁力架不匹配怎么办可以用和磁力架匹配的酶标板来替代试剂盒中的酶标板如果需要也可以将型号发给我们确认。7. 代测样本需要怎么寄送有条件用干冰若无干冰也可使用冰袋尽量保持低温运输。8. 代测的样本建议放在什么样本管中建议用尖底的EP管装样品0.5mL的EP管最好用1.5或2mL甚至更大的EP管装液体样本送样会增加取样损耗同时样本蒸发和管壁粘附也会导致样品损失所以寄送时需要算上10%的损耗。