大家好这里是专注表观组学十余年领跑多组学科研服务的易基因。2026年6月27日湘湖实验室(农业浙江省实验室)李果研究员/顾志敏研究员、重庆妇幼医院江雯研究员、浙江大学姚远研究员团队合作在《Cell Communication and Signaling》期刊发表题为“Programmable aging function-related mitochondrial DNA 5-methylcytosine (m5C) modification with a TALE-directed methyltransferase”的高水平科研成果。该研究开发了一种名为MEEMitochondrial Epigenetic Editor的新型线粒体表观遗传编辑器实现对线粒体DNAmtDNA特定位点的可编程5-甲基胞嘧啶5mC甲基化修饰为研究线粒体表观遗传学及衰老相关疾病提供全新技术平台。英文标题Programmable aging function-related mitochondrial DNA 5-methylcytosine (m5C) modification with a TALE-directed methyltransferase译文标题TALE导向甲基转移酶介导的衰老相关线粒体DNA 5-甲基胞嘧啶可编程修饰发表时间2026年6月27日发表期刊Cell Communication and Signaling影响因子:IF11.6/Q1技术平台WGBS、RNA-seq等易基因金牌技术作者单位湘湖实验室(农业浙江省实验室)、重庆妇幼医院、浙江大学、中国农业大学等DOI:10.1186/s12964-026-03030-8线粒体表观遗传编辑在不改变线粒体DNAmtDNA序列前提下调控内源线粒体基因表达为调控致病性线粒体基因提供了一种潜在策略。本研究开发的由线粒体靶向TALE模块与Dnmt3A和Dnmt3L甲基转移酶融合而成的线粒体表观遗传编辑器(MEE)可以高效介导细胞线粒体DNA位点特异性5mC甲基化且脱靶活性极低。研究证明MEE介导的C12191H位点甲基化效率超过53%并使人细胞中MT-ND5 mRNA的稳态水平降低约95%。在体内实验中MEE使衰老相关位点C11168H甲基化增加了11.76%导致靶标脑区MT-ND4表达降低并改变小鼠血浆中t-Tau和NFL水平。本研究结果表明在不改变mtDNA序列的前提下MEE能够高效抑制靶基因表达并在体内和体外调控与衰老相关的mtDNA甲基化模式为研究线粒体表观遗传学在衰老及相关疾病中的作用提供了强大且精确的工具。研究方法1质粒设计与构建D3A-D3L融合蛋白、线粒体靶向序列MTS、TALE蛋白模块、载体构建、质粒验证2细胞培养与转染HEK293T细胞3mtDNA提取、线粒体蛋白分离及Western Blot分离HEK293T细胞的线粒体蛋白特异性抗体抗ND5、COX1、COX2、COXIV孵育并检测蛋白表达水平。4亚硫酸氢盐测序PCRBSP计算甲基化率。5基因表达检测qPCR计算相对表达量。6全基因组重亚硫酸盐测序WGBSWT细胞、Dnmt3A敲除细胞、Dnmt3A过表达细胞9个样本以及WT细胞、GFP对照、三个MEE靶向位点实验15个样本。计算全基因组甲基化水平和差异甲基化。7动物实验使用C57BL/6J小鼠包括1、3、5、12、21月龄的梯度年龄小鼠。MEE由PHP.eB AAV包装通过尾静脉注射1011 vg/只至4周龄小鼠体内。3周后取脑组织小脑、皮层、海马、纹状体和血液进行后续的mtDNA甲基化、RNA-seq及血浆衰老生物标志物IGF-1, NFL, p-Tau等检测。结果图形1线粒体表观遗传编辑器设计研究首先通过构建Dnmt3A敲除细胞、过表达MTS-Dnmt3A的细胞以及野生型对照三种HEK293T细胞模型来验证Dnmt3A在线粒体DNA甲基化中的功能。研究团队通过全基因组亚硫酸氢盐测序WGBS分析发现Dnmt3A敲除破坏了区域性甲基化模式并改变线粒体基因表达而MTS-Dnmt3A过表达显著提高mtDNA甲基化水平并引入了链特异性甲基化偏倚图1a、b。具体而言在重链H链和轻链L链上均观察到甲基化峰主要位于基因-基因边界区域且L链的CpG甲基化表现出明显偏倚。基于上述发现研究团队设计了线粒体表观遗传编辑技术平台MEE通过将MTS、Dnmt3A和Dnmt3L融合到TALE DNA结合支架上实现mtDNA位点的可编程图1c。为评估MEE的甲基化效率研究选择ND2和ND5基因中的三个特定位点进行测试。结果显示MEE在转染后2天和6天分别实现MT-ND2位点1的33.7%和41.7%、MT-ND2位点2的33.3%和45.8%、MT-ND5位点的20.8%和70.8%的5mC甲基化效率图1d。这些结果表明MEE具有良好的位点特异性甲基化活性且甲基化效率随时间延长而增加。图1线粒体DNA甲基化的链特异性分析及线粒体表观遗传编辑器MEE开发2MEE实现高效的mtDNA甲基化为进一步验证MEE功能研究团队挑选了在之前Dnmt3A实验中差异显著的20个mtDNA位点分布在MT-RNR1、MT-ND1、MT-COX1、MT-COX2、MT-ATP8、MT-COX3、tRNA、MT-ND5和MT-CYTB等基因上图2c。将靶向这些位点的MEE质粒转染HEK293T细胞72小时后分选GFP阳性细胞进行BSP和qPCR/Western Blot分析。结果表明MEE介导的甲基化水平与靶基因的mRNA及蛋白水平下调显著相关图2d-f。而催化失活的dMEE对mRNA的降低作用较弱表明MEE的基因沉默效应是位点占有率与Dnmt3A介导的甲基化共同作用的结果。图2线粒体表观遗传编辑器(MEEs)的功能验证3MEE具有高度特异性为评估MEE的特异性研究团队选择MT-RNR1的C15634(L)、MT-ND1的C3687(H)和C3951(H)三个靶位点进行全基因组亚硫酸盐测序WGBS和RNA测序RNA-seq分析。WGBS数据分析显示与GFP转染对照相比MEE处理组分别鉴定出786、771和771个差异5mC甲基化位点与野生型对照相比分别鉴定出748、730和731个差异位点图3a-b。在线粒体基因组中与GFP对照相比分别检测到480、479和507个差异甲基化位点与WT对照相比分别检测到229、201和192个差异位点而GFP转染组仅检测到4个图3c-d。RNA-seq分析显示与野生型细胞相比MEE处理组的下调基因数DRGs分别为868、547和373个而GFP对照组为675个图3e-h。由于GFP对照组也观察到相当数量的基因表达变化这些差异甲基化和基因表达变化可能受到转染相关效应的影响。综合WGBS和RNA-seq数据表明在测试条件下MEE的脱靶活性非常有限。图3线粒体表观遗传编辑器(MEEs)的脱靶5mC甲基化分析(4) 衰老小鼠表现出异常的mtDNA 5mC甲基化模式研究团队选取1、3、5、12、21月龄的C57BL/6小鼠对应人类0-70岁对其脑和胸腺组织的全基因组亚硫酸盐测序WGBS分析结果显示年轻与衰老小鼠之间存在显著的5mC甲基化位点差异。在脑组织中各年龄组的线粒体基因组表现出强L链CpG甲基化偏倚保守的峰值位点主要位于基因-基因边界图4b-c。这些发现提示年龄相关的生物标志物变化可能与mtDNA 5mC甲基化相关MEE可作为研究衰老表观遗传机制的有前景工具。图4衰老小鼠组织中链特异性线粒体DNAmtDNA甲基化动态变化5MEEs在体内实现高效的年龄相关mtDNA甲基化为评估MEE的体内甲基化效率和治疗潜力研究团队靶向小鼠脑组织中MT-RNR2的C2383(H)、MT-ND2的C3933(H)和MT-ND4的C11168(H)三个衰老相关mtDNA甲基化位点。将MEE包装入PHP.eB AAV载体对4周龄C57BL/6J小鼠静脉注射1011 vg3周后收集脑组织和血浆图5a-b。GFP免疫荧光证实PHP.eB AAV在中枢神经系统的高效转导图5c。WGBS和BSP分析显示在小脑组织中C11168(H)位点的甲基化效率达到11.76%图5d。RNA-seq和qPCR评估显示C2383-MEE显著下调皮层中MT-RNR2表达C3933-MEE降低海马和纹状体中MT-ND2表达C11168-MEE抑制小脑中MT-ND4表达图5e-g。生化分析显示衰老相关血浆生物标志物发生改变C2383-MEE组p-Tau变化、C3933-MEE组t-Tau变化、C11168-MEE组t-Tau和NFL变化图5h。通过线粒体基因组甲基化文库构建和测序分析在所有组别的脑组织样本中未检测到额外的差异甲基化脱靶位点。这些结果证明MEE可在体内介导mtDNA甲基化扰动衰老相关表观遗传位点为线粒体表观基因组研究和机制研究建立了有用工具。图5MEE介导的体内年龄相关mtDNA 5mC甲基化结论和启示本研究通过开发MEE这一创新工具成功实现在不改变mtDNA序列的前提下对线粒体基因进行可编程的表观遗传调控。MEE在细胞和活体小鼠中均展现出高效、特异性的mtDNA 5mC甲基化编辑能力并能有效沉默靶基因。该研究将从前的mtDNA甲基化与衰老的关联观察推向了可进行因果验证的新阶段为深入理解线粒体表观遗传学在衰老以及神经退行性、代谢性疾病中的作用提供了强有力的实验平台。WGBS在本研究中的重要作用Dnmt3A功能验证通过WGBS比较WT、Dnmt3A-KO和MTS-Dnmt3A-OE细胞的mtDNA甲基化谱系统揭示Dnmt3A对线粒体DNA甲基化的调控作用发现链特异性甲基化偏倚为MEE设计提供理论基础图1a-b。MEE靶点筛选基于WGBS数据筛选出20个甲基化效率差异最显著的位点作为MEE靶点确保编辑器的靶向效果。脱靶效应评估WGBS通过比较MEE处理组与GFP/WT对照的核基因组和线粒体基因组甲基化谱定量分析差异甲基化位点数量得出“有限可检测脱靶活性”结论图3a-d。对基因编辑工具的临床转化安全性评估至关重要。衰老甲基化图谱绘制WGBS揭示了衰老过程中mtDNA 5mC甲基化的动态变化发现脑组织L链CpG甲基化偏倚的年龄保守性为识别衰老相关靶点提供依据图4b、c。体内编辑验证WGBS用于确认AAV递送MEE后的体内甲基化效率C11168位点11.76%和脱靶检测支撑了MEE从细胞到动物的转化应用图5d。易基因DNA甲基化整体研究方案DNA甲基化是一种表观遗传修饰指DNA分子在DNA甲基转移酶的作用下将甲基选择性地添加到特定碱基上的过程。主要发生在胞嘧啶的CpG位点也可以在非CpG位点和CpG岛中发生。DNA甲基化参与调控基因表达、X染色体失活、基因印记、胚胎发育、细胞分化、肿瘤发生以及维持基因组稳定性。参考文献Li G, Zhou X, Zhu G, Cheng Y, Pan Y, Guo X, Liao G, Li X, Hu X, Yao Y, Gu Z, Jiang W. Programmable aging function-related mitochondrial DNA 5-methylcytosine (m5C) modification with a TALE-directed methyltransferase. Cell Commun Signal. 2026 Jun 27.doi: 10.1186/s12964-026-03030-8.