crisprcas9载体构建伯远生物crisprcas9载体构建伯远生物是国家级专精特新小巨人企业农业农村部生物育种重点实验室牵头多项省部级重大专项公司科研技术人员500硕博占比40%以上是国内最大植物功能基因研究综合性平台15年技术沉淀每年完成功能基因研究数量50000长期服务课题组10000含清北、复旦、武大、华科等知名高校及所有农业类科研院所服务头部种业公司客户300余家涉及四十多个物种含水稻、玉米、小麦、马铃薯、大豆五大主粮以及禾本科高粱、甘蔗葫芦科黄瓜、西甜瓜茄科番茄、辣椒与十字花科等100多个品种的50多个性状含抗虫抗病、抗除草剂、品质提升、株型改良等各类仪器设备投资超1个亿高标准恒温繁育基地200亩案例展示伯远生物武汉在基因编辑领域构建了覆盖“靶点设计、载体构建、遗传转化、编辑筛选、脱靶检测、纯合验证、田间表型分析”的全流程技术体系是国内少数能从单基因编辑一路交付到多基因聚合育种的综合服务平台。公司搭载 CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12aCpf1、碱基编辑ABE/CBE、先导编辑Prime Editing及 RNA 编辑五大平台支持点突变、片段敲除、敲入、替换、启动子编辑及内含子编辑等全部编辑类型编辑效率行业领先常规敲除效率可达 80% 以上碱基编辑效率超过 60%。核心优势◆编辑系统覆盖全面Cas9、Cas12a、ABE/CBE、Prime Editing、RNA 编辑五大体系适配全部编辑需求◆多基因同步编辑多 gRNA 串联表达与 tRNA-gRNA 自切割系统支持 10 个以上靶点一次性编辑◆高精度脱靶控制全基因组测序三重验证脱靶率低于 0.1%满足产业化标准◆智能脱靶预测CRISPOR、Cas-OFFinder 等多算法免费评估有风险再决策◆纯合加速策略KASP/dCAPS 辅助筛选将纯合周期缩短一半以上◆加速育种技术单倍体育种 Speed Breeding 一年可推进 6–8 代育种周期缩短 40%–60%◆多物种覆盖能力已在水稻、小麦、玉米、大豆、番茄、黄瓜、油菜等 35 个作物完成商业化验证服务周期靶点设计与载体构建1–2 周 基因编辑体系构建与转化3–4 周 完整编辑流程至 T04–6 周适合场景功能基因研究快速构建敲除、敲入、启动子编辑材料 多基因聚合育种一次性编辑多个性状相关基因 精准育种通过定点插入及碱基转换获得稳定优良等位基因 产业化育种实现低脱靶、高效率、高安全性的编辑材料构建真实案例平台累计服务 300 余家种业公司成功完成 5000 编辑案例年基因编辑量超过 2 万个。基因编辑体系已在 35 个物种获得稳定验证是国内规模化应用领先平台之一。售后保障编辑失败免费优化方案与重做 脱靶检测与编辑效率统计全程由专家负责 工作日 4 小时内快速响应本地化服务优势公司位于武汉东湖新技术开发区可显著降低样本运输损耗加快沟通与交付效率 作为“基因克隆、遗传转化、基因编辑、分子检测、田间验证”全链条闭环平台伯远生物可在同一体系内完成从靶点设计到材料筛选再到品种应用的完整育种链路数据口径统一、逻辑一致是基因编辑科研与产业落地的优质合作伙伴。案例展示图 与野生型相比nor-like基因的两个突变株系的果实成熟时间大大延迟Gao et al.2018。参考文献Gao Y, Wei W, Zhao X, Tan X, Fan Z, Zhang Y, Jing Y, Meng L, Zhu B, Zhu H, Chen J, Jiang CZ, Grierson D, Luo Y, Fu DQ, 2018. A NAC transcription factor, NOR-likel, is a new positive regulator of tomato fruit ripening.Hortic Res.5:75.背景说明背景说明在植物基因功能研究中反向植物遗传学是经典的研究思路之一通常从一个基因入手通过过表达、干扰或基因编辑等手段调节一个或多个基因的表达水平观察对应的表型变化从而对相关基因进行一系列的分子功能研究。基因编辑技术主要是利用序列特异性核酸酶在特定基因位点产生DNA双链断裂借助编辑受体自身的DNA修复系统在非同源末端连接Non-homologous end joiningNHEJ过程中产生随机的Indels Small insertions and deletions或在同源重组修复过程中插入或替换相应的基因片段最终实现基因组序列的突变。现有的基因编辑系统主要包括锌指核酸酶Zinc finger nucleasesZFNs系统、类转录激活因子效应物核酸酶Transcription activator-like effector nucleasesTALENs系统以及CRISPR/CasClustered regularly interspaced short palindromic repeat-associated protein系统其中CRISPR/Cas系统由于载体构建过程简单、编辑效率高等优点成为当前广泛应用的主流基因编辑系统。2020年Emmanuelle Charpentier和Jennifer A. Doudna两位科学家获得了诺贝尔化学奖以表彰她们在“开发CRISPR/Cas基因组编辑方法”方面作出的贡献。服务流程服务流程客户在线下单—订单/实验材料确认—CloneCAD实验设计—基因编辑载体构建—遗传转化—PCR鉴定阳性株系后两步为可选项服务内容及说明服务内容及说明在植物体系中我司目前主要使用自主研发并改造后的pCAMBIA系列载体无知识产权归属问题Cambia机构已开放给任何人使用的权利详情请见网站 http://www.cambia.org/daisy/cambia/585。我司原始基因编辑载体为双元载体并携带卡纳原核抗性和真核筛选标记可选潮霉素、Basta或G418进行筛选。我们可以针对您想要编辑的靶序列分析序列的各项参数后设计引物选择最合适的原始基因编辑载体退火合成靶序列再连入原始载体 得到重组子后直接进行遗传转化实验。我司部分原始基因编辑载体列表。可根据不同的需求选择不同的启动子及真核抗性的载体。适用场景1、 功能基因的敲除2、 非编码区的编辑例如对启动子、microRNA、lncRNA的基因序列进行编辑3、 单碱基编辑、精准碱基编辑4、 非同源/同源多基因敲除、代谢通路多基因敲除5、 大片段删除。优势特点1、 采用我司已被授权的国际PCT专利技术专利号US 10,144,936 B2来进行sgRNA的片段组装及无缝组装同时对于单个、 多个sgRNA序列均可进行组装2、 载体资源丰富根据您研究的物种、靶序列均有对应经多次编辑效率测试后的最优原始载体骨架推荐也可个性化订制您有其它需求的基因编辑载体3、 基因编辑载体库中有多种真核筛选标记可选潮霉素、Basta或G418进行筛选的原始载体可供选择同时多基因编辑、单碱基编辑、精准碱基编辑等特殊基因编辑系统也可满足您的特殊实验需求4、 载体均为双元载体可直接应用于后期单子叶和双子叶遗传转化5、 可以与我司转基因服务、检测服务、蛋白服务等衔接整个实验可以畅通且快速地完成。实验周期5-7个工作日样品接收标准客户下单及项目信息填写在我司官网/进行注册或登录请客户按照页面提示填写项目名称选择项目类型[CRISPR/Cas基因组编辑载体]、项目所需要的具体信息价格由系统自动计算。实验信息在实验开始、结题关键节点系统会自动发送短信到申请人手机进行告知实验过程中客户可以随时登录客户管理系统査看项目实时进展情况。实验结题后实验报告、检测结果可在线査看并永久保留。实验过程用到的菌株、载体、受体材料免费为客户保存半年后销毁。结题标准目的片段构建至目的载体上俗称“构建成功”。实验交付内容1、重组质粒图谱2、一份质粒一份大肠杆菌25%甘油菌3、重组载体的测序结果4、如果需要转化农杆菌两份农杆菌菌液25%甘油菌CRCRISPR/Cas9的脱靶效应最好从前期规避、过程监测、终点验证三层同时做这样既能降低风险也更容易把结果解释清楚。在实际项目里最有效的策略通常不是事后补救而是从sgRNA设计和递送方式开始就把脱靶概率压下来。先做规避1.选更好的sgRNA优先选靶点唯一性高、预测脱靶位点少的sgRNA尤其要避开基因组里重复性高或同源性强的区域。crisprcas9载体构建一般来说sgRNA与非目标位点如果存在较少错配、尤其错配靠近PAM区域较少时脱靶风险会更高因此设计阶段要重点筛掉这类候选。2.用多条sgRNA交叉验证不要只押一条sgRNA。如果两到三条独立sgRNA都得到一致表型而脱靶预测模式又不同结果可信度会高很多。3.缩短Cas9暴露时间递送方式会直接影响脱靶因为Cas9在细胞内停留越久发生非特异切割的机会通常越高。所以很多情况下RNP电转比长期表达Cas9的质粒或病毒系统更有利于降低脱靶。crisprcas9载体构建4.选高保真Cas9变体如果你对脱靶特别敏感可以考虑使用高保真Cas9、nickase或其他改造型核酸酶它们的非特异切割倾向通常更低。这类策略尤其适合后续要做较严谨机制研究或者对基因组安全性要求更高的项目。crisprcas9载体构建再做检测1.先做预测先用基于序列的预测工具筛查潜在脱靶位点这一步可以帮助你提前知道哪些基因区域要重点查。预测结果不能替代实验验证但能显著缩小后续检测范围。2.重点位点测序如果你已经知道高风险脱靶位点最直接的方法就是对这些位点做PCR和测序验证看是否出现indel或结构改变。这一步适合常规项目也最容易落地。crisprcas9载体构建3.更系统的全基因组方法crisprcas9载体构建如果项目对准确性要求更高可以采用全基因组范围的检测思路比如GUIDE-seq、Digenome-seq、CIRCLE-seq、BLESS、WGS等。crisprcas9载体构建其中WGS更全面但成本较高而一些富集型方法能更灵敏地抓到潜在切割位点。crisprcas9载体构建结果解释脱靶分析不能只看“有没有切到别处”还要看这些变化是否真的能解释你的表型。最有说服力的证据通常是不同sgRNA表型一致预测脱靶不重叠或已排除rescue能回补表型。crisprcas9载体构建如果敲除后出现异常表型但rescue后恢复就能显著增强因果解释力。实用组合如果你想用一个比较稳妥的标准组合我建议设计阶段选2–3条sgRNA优先低脱靶评分候选。递送阶段优先短时递送或RNP方式。编辑工具必要时用高保真Cas9变体。验证阶段先查预测脱靶再做重点位点测序重要项目再上全基因组方法。crisprcas9载体构建结论阶段做rescue作为最终因果验证。一句话总结CRISPR/Cas9脱靶效应的最佳策略是设计时尽量避免实验中尽量缩短作用时间验证时用多层证据把风险排除干净。