慢病毒载体构建伯远生物慢病毒载体构建伯远生物是国家级专精特新小巨人企业国家级重点实验室牵头多项省部级重大专项公司科研技术人员500硕博占比40%以上作为功能基因研究综合性平台15年技术沉淀每年完成功能基因研究数量50000长期服务课题组10000含协和、同济、华西、湘雅、中山、军事医学院等顶尖医学研究机构各类仪器设备投资超1个亿案例展示案例展示1、慢病毒感染细胞效率实例图 慢病毒感染细胞效率2、慢病毒体内表达应用实例图 慢病毒体内表达应用实例Shi Y, et al. 2017。参考文献Mátrai J, Chuah MK, VandenDriessche T. Recent advances in lentiviral vector development and applications.Mol Ther. 2010;18(3):477-490.Shi Y, Ping YF, Zhou W, et al. Tumour-associated macrophages secrete pleiotrophin to promote PTPRZ1 signalling in glioblastoma stem cells for tumour growth.Nat Commun.2017;8:15080.我司默认采用三质粒系统进行包毒若为过表达慢病毒包装则需目的基因在3000bp以内如有个性化要求请致电详联背景说明背景说明通常LVs是通过反式互补产生的其表达系统由用于表达特定基因的目的质粒及病毒gag/pol、Rev和VSVG等组分的包装质粒组成其中包装质粒提供了病毒基因组mRNA包装成完整毒粒所必需的结构蛋白、聚合酶和包膜蛋白。LVs具有感染谱广泛、可以有效感染分裂期和静止期细胞、长期稳定表达外源基因等优点区别于一般的逆转录病毒载体其对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。携带有外源基因的LVs在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒通过感染细胞或活体组织实现外源基因在细胞或活体组织中表达。通常根据不同的实验目的针对LVs改造以进行启动子活性研究、基因表达研究、基因沉默等研究。外源基因则通过载体中的多克隆位点插入LVs以进行表达。图 反式互补生产LVsMátrai et al. 2010。原理简介携带有外源基因的LVs在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒通过感染细胞或活体组织实现外源基因在细胞或活体组织中表达。LVs包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞在细胞中进行病毒的包装包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中离心取得上清液后可直接用于宿主细胞的感染目的基因进入到宿主细胞之后经过反转录整合到基因组从而高水平的表达效应分子。通常根据不同的实验目的针对LVs改造以进行启动子活性研究、基因表达研究、基因沉默等研究。外源基因则通过载体中的多克隆位点插入LVs以进行表达。图 慢病毒包装和侵染过程示意图我司载体简介我司可提供丰富的LVs产品体系用于操作编码基因和非编码基因如lncRNA、miRNA、circRNA。我司原始细胞慢病毒包装载体列表可根据不同的需求选择不同的载体插入不同的位置服务流程服务流程客户在线下单——订单/实验材料确认——构建LVs包装载体与目的载体——共转染293T细胞——病毒上清收集——病毒浓缩和纯化——慢病毒鉴定包括病毒滴度、质粒残留、宿主DNA残留、BSA残留、支原体检测、衣原体检测、内毒素检测、细菌及真菌检测等——可选后续感染目的细胞及相关实验我司默认采用三质粒系统进行包毒若为过表达慢病毒包装则需目的基因在3000bp以内如有个性化要求请致电详联服务内容及说明服务内容及说明慢病毒滴度鉴定方法检测项目原理优点缺点GEP荧光计数流式细胞计数经典方法重复性好检测活性病毒感染滴度仪器和操作要求高操作复杂绝对定量qPCR病毒感染工具细胞后抽提整合目的片段的细胞基因组DNA与标准品比较检测活性病毒感染滴度最接近真实滴度仪器和操作要求高操作复杂RT-qPCR病毒梯度稀释感染工具细胞后抽提RNART-qPCR检测病毒基因组表达检测活性病毒感染滴度受限于病毒感染后检测基因表达丰度p24核心蛋白ELISA定量对慢病毒颗粒稳定表达的p24蛋白进行ELISA检测简单、快捷、重复性好反映的是病毒物理颗粒数不是活性滴度适用范围现在LV系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA干扰、miRNA研究以及活体动物实验中。客户下单及项目信息填写在我司官网http://www.biorun.com/进行注册或登录请客户按照页面提示填写目的基因信息、载体构建详情后续感染的细胞可选自行提供或我司提供。实验信息实验过程中客户可以随时登入管理系统查看项目实时进展情况。实验结题时系统会通过短信自动通知客户并发送实验报告查看网址。实验结题后实验报告、检测结果可在线查看或打印并永久保留。实验周期致电详询实验交付内容1、所有实验的原始数据包括实验过程、实验试剂与设备等2、重组载体的全序列信息和注释信息3、重组载体的酶切图谱4、重组载体测序结果5、引物序列6、病毒质控鉴定报告与结果分析包含滴度鉴定、BCA检测、支原体检测等可选7、高滴度慢病毒载体不低于108TU/mL8、阴性对照病毒9、稳转细胞株可选。慢病做过表达实验慢病毒载体设计的核心就不是“把基因放进去”这么简单而是要同时兼顾表达强度、蛋白功能完整性、筛选方便性和后续验证可操作性。设计主线先确定你要做的是哪一种过表达瞬时过表达适合快速摸底表达、定位和初步功能验证。稳定过表达适合长期表型、救援实验和重复性更高的机制研究。带标签过表达适合WB、IP、IF、pull-down和互作分析。如果你是做功能研究我更建议优先做稳定或可转稳定的慢病毒过表达载体因为它更适合后续表型、通路和救援实验。启动子选择对于过表达最常见的启动子是CMV、EF1α、CAG一类强启动子。如果你想要“短期高表达”CMV往往是第一选择如果你担心某些细胞中CMV容易沉默EF1α通常更稳。如果你的细胞类型比较特殊建议先小规模比较两个版本再决定最终骨架。标签怎么放慢病毒载体构建做功能研究时标签一定要优先考虑“不影响功能”。首选小标签FLAG、HA、Myc、His这些对蛋白功能影响通常较小适合做WB、IF、IP和定位。如果蛋白难表达或难纯化可以考虑GST、SUMO、MBP这类更大的融合标签但它们更可能干扰天然功能最好做可切除设计。N端还是C端如果N端有信号肽、定位序列、磷酸化位点或功能核心通常优先把标签放C端反过来如果C端更关键就放N端。我的经验上做功能研究时先做无标签版和小标签版各一个是很值的至少能避免后面解释“表型到底是蛋白本身还是标签影响”的麻烦。筛选标记怎么选如果你要做稳定株常见筛选标记是Puro、Neo、Hygro、Bsd其中Puro最常用也最方便。如果只是瞬时过表达筛选标记不是必须但带一个荧光报告基因会更方便看转染效率。不过要注意报告基因会增加载体长度可能影响包装效率所以如果你更重视病毒滴度报告基因不是一定要加。如果是分泌蛋白或膜蛋白这类蛋白设计要更谨慎。如果是分泌蛋白通常要保留天然信号肽如果天然信号肽效率差再考虑替换成常见高效信号肽。如果是膜蛋白要特别注意跨膜区和胞内尾部标签位置尽量避开功能关键区不然很容易出现“表达有了但功能全没了”。一个实用模板如果你现在还没有明确限定我会建议你按下面这个思路搭第一版骨架慢病毒过表达载体。启动子CMV或EF1α。标签C端FLAG或HA。筛选Puro。