TitleBeyon gene expression: Single-cell transcriptomics at isoform resolution中文标题超越基因表达单细胞转录组学与异构体分辨率期刊Trends in GeneticsIF12.9发表时间2026.7.9过去绝大多数主流scRNA-seq方法只捕获转录本的末端3或5端这意味着我们能看到的只是某个基因表达了多少却看不到这个基因表达的到底是哪个转录本isoform。这篇发表在《Trends in Genetics》上的综述系统梳理了isoform分辨率单细胞转录组学单细胞三代全长转录组技术这一新兴领域——即能够捕获全长转录本、进而解析可变剪接和isoform多样性的单细胞测序技术。作者认为转录组是连接基因型与表型的桥梁而isoform分辨率的单细胞技术正在为理解基因调控机制、细胞功能和表型复杂性提供前所未有的洞察力。在isoform分辨率上揭示单细胞转录组异质性细胞的功能多样性从根本上由转录组异质性决定——同一个基因座可以通过可变剪接、可变转录起始位点、可变多聚腺苷酸化等机制产生功能迥异的多个转录本isoform。Bulk RNA-seq把一群细胞的转录组混在一起测抹平了细胞间差异。传统末端聚焦scRNA-seq虽然能看单个细胞但只统计转录本数量末端reads计数无法区分同一基因的不同isoformisoform多样性因此长期被忽视。Isoform分辨率scRNA-seq包括能够跨越全长转录本的短读长技术以及能端到端直接测序全长转录本的长读长技术如PacBio、Oxford Nanopore/ONT。这类技术让我们第一次能在单细胞水平上同时看到表达了什么基因和表达的是哪个isoform。末端聚焦scRNA-seq中isoform a和isoform b的3#39;端reads覆盖高度相似因此计数结果看起来quot;相等quot;而isoform分辨率scRNA-seq中全长read覆盖清晰地区分出两种isoform的结构差异及各自的转录本计数两者计数并quot;不相等quot;——这正是isoform分辨率技术的核心价值所在。scRNA-seq技术的演进综述将过去十五年scRNA-seq技术的演进归纳为三大类分别在细胞分离/条形码策略手动移液、荧光分选、微流控芯片、液滴、微孔、原位组合条码和cDNA合成策略poly(A)加尾、模板转换、体外转录、滚环扩增、程序化cDNA串联上各有侧重。01末端聚焦scRNA-seq这是目前应用最广、通量最高的一类方法主要基于Illumina短读长平台。早期手工/分选类方法STRT-seq、CEL-seq、MARS-seq通过人工移液或荧光激活细胞分选FACS分离单细胞结合模板转换或体外转录进行低起始量文库制备同时期独特分子标签UMI被引入以校正PCR重复、提升定量准确性。液滴法的突破2015年inDrop和Drop-seq将单细胞与带有细胞条形码的磁珠共同封装进纳升级液滴为10x Genomics Chromium平台的广泛普及铺平了道路。DroNc-seq和snDrop-seq进一步将液滴流程适配到单核RNA测序使冷冻组织的基因表达谱分析成为可能。微孔板方法CytoSeq、Seq-Well、Microwell-seq系列将细胞和条形码磁珠嵌入微孔中提升了成本效益和可扩展性。原位组合条码法sci-RNA-seq、SPLiT-seq通过分割-混合split-and-pool迭代条码化绕开了物理上的单细胞分离步骤后续的sci-RNA-seq3、scifi-RNA-seq将通量进一步推高到单次实验百万级细胞规模。这类方法虽然通量和灵敏度不断提升但很多协议在中间步骤其实合成了全长cDNA只是后续被打断以适配短读长测序——这意味着只要稍加改造它们中不少可以被改造用于isoform分辨率分析。02跨越全长转录本的短读长scRNA-seq短读长测序虽以末端定量为主流应用但通过特定的建库策略同样可以实现全长转录本覆盖Tang et al.2009史上第一个scRNA-seq协议采用poly(A)加尾和第二链合成就已具备isoform分析能力。Smart-Seq通过模板转换和转座酶tagmentation建库实现全长转录本覆盖。Quartz-Seq通过核酸外切酶消化和抑制性PCR改进了基于poly(A)的扩增。Smart-seq2优化了逆转录、模板转换和预扩增步骤提升了检测灵敏度和转录本覆盖均匀性成为isoform分辨率短读长scRNA-seq的代表性方法之一。Smart-seq3 / Smart-seq3xpress在保持全长覆盖的同时引入5 UMI是isoform分辨率分析的重要进展。FLASH-seq将逆转录和cDNA预扩增步骤合并进一步简化流程、提高灵敏度。局限在于短读长本质上需要通过计算方法重建而非直接观测全长转录本这意味着isoform推断存在一定的不确定性。03端到端全长转录本测序的长读长scRNA-seq长读长RNA测序能在单细胞分辨率下实现端到端的转录本测序直接观测而非计算重建全长isoform。PacBioSMRT测序DNA聚合酶被固定在零模波导ZMW纳米孔中实时检测荧光标记核苷酸的掺入通过环形一致性测序CCS让聚合酶多次通过同一个环化模板获得高保真长读长准确率可达99.9%长度可达25kb。ONT纳米孔测序核酸分子穿过嵌在膜上的蛋白纳米孔通过离子电流的特征扰动解码序列读长常超10kb甚至可达兆碱基级别且独特地支持天然RNA分子的直接测序无需逆转录成cDNA从而能检测RNA修饰。早期探索是把已有的单细胞cDNA扩增协议与长读长测序平台结合STRT-seq PacBioFluidigm C1平台揭示了小鼠脑内单细胞isoform多样性。改良版Smart-seq2 ONT捕获了小鼠B细胞及植入前胚胎的单细胞isoform变异。ScISOr-Seq将10x Genomics Chromium平台与PacBio测序结合实现了大规模细胞群体的单细胞全长isoform分析。基于isoform分辨率scRNA-seq的转录组分析01转录本isoform一个基因座可以通过可变剪接、可变转录起始、可变多聚腺苷酸化等机制产生多个转录本isoform这种isoform变异在多细胞真核生物中广泛存在是塑造调控和表型复杂性的重要力量。短读长isoform分辨率协议如Smart-seq2、Smart-seq3生成跨越全长转录本的reads可以检测和定量单细胞中的可变剪接但受限于短读长固有的局限性——需要计算重建而非直接捕获全长转录本。长读长scRNA-seq则能全面地发现和定量全长转录本已被广泛应用于细胞分化、发育和器官发生过程中的isoform变异研究揭示了不同细胞群体间广泛的isoform多样性。在癌症研究中转录本isoform变异十分普遍并主动参与癌症标志性特征的形成一系列长读长scRNA-seq研究已在多种癌症类型中探索了单细胞水平的isoform变异为疾病机制、生物标志物和治疗靶点提供了新见解。02核苷酸分辨率变异除了isoform层面RNA-seq数据还能检测核苷酸分辨率的变异包括种系变异germline variants、体细胞变异somatic variants和RNA编辑事件。种系和体细胞变异的检测支持一系列下游应用解析单细胞转录组调控的遗传结构、揭示肿瘤中的细胞异质性和克隆演化等。Monopogen是专为短读长单细胞数据开发的变异检测工具适用于Smart-seq2、Smart-seq3等isoform分辨率协议。随着长读长测序碱基识别准确率的提升长读长RNA-seq数据也越来越多地用于变异检测。例如scNanoGPS能同时检测转录本isoform和调用变异将单细胞基因型与全长转录组关联揭示肿瘤和免疫细胞中细胞类型特异性的变异。ONT scRNA-seq数据也被用于量化小鼠胚胎脑中的RNA编辑水平揭示了离子型谷氨酸受体基因Gria2在神经祖细胞和成熟神经元之间的差异编辑水平。03等位基因特异性表达与转录本结构通过在单细胞reads中联合表征转录本表达和序列变异并将reads分配到特定等位基因或单倍型isoform分辨率scRNA-seq能够揭示等位基因特异性表达和等位基因特异性转录本结构——这些细胞类型特异性的遗传调控机制在bulk组织研究中往往被掩盖。Smart-seq3等短读长isoform分辨率协议已被用于量化单细胞中等位基因和isoform特异性的转录本表达通过比较个体的两个等位基因可以揭示转录本表达和结构上的等位差异。长读长RNA-seq在此维度上优势明显相比短读长它能提供转录本结构的完整视图并直接将其与全长read内的等位序列变异关联起来从而大幅增强等位基因特异性分析能力。例如Byrne等人使用靶向长读长scRNA-seq协议在卵巢癌特定细胞群体中检测到了转录本表达和结构上的等位差异。04转座元件来源的转录本转座元件TE在哺乳动物基因组中十分丰富其在基因调控中的作用早已超越了曾被视为垃圾DNA的旧认知。TE经常在转录组中表达既可以作为独立的转录单位也可以作为已有基因的一部分——通过TE来源的外显子、转录起始位点或多聚腺苷酸化位点参与基因结构。核心挑战TE的重复性特征使得RNA-seq reads很难被唯一映射到单个TE基因座这对短读长RNA-seq分析TE来源转录本无论在bulk还是单细胞层面尤其棘手。短读长scRNA-seq研究应对这一挑战的方式包括将reads归类到TE亚家族水平的元基因metagene或概率性地将多重映射的reads重新分配到单个TE基因座。长读长测序天然地缓解了映射歧义问题增强了单细胞水平TE来源转录本的分析能力。例如CELLO-seq结合长读长scRNA-seq和定制化计算流程在基因座和细胞类型分辨率上表征和量化TE来源的转录本isoform揭示了小鼠胚胎和人诱导多能干细胞中TE表达的广泛异质性。05融合转录本融合转录本是由染色体重排、远距离基因间的trans-splicing或相邻基因间的cis-splicing所产生的嵌合RNA。它们在多种癌症中普遍存在是重要的诊断标志物和治疗靶点。尽管已有许多针对bulk RNA-seq数据短读长或长读长的融合检测计算工具但专门针对单细胞数据的方法仍然有限。单细胞层面的融合转录本检测因文库人工假象和数据稀疏性而更加复杂这会降低检测的特异性和灵敏度。scFusion整合了统计模型与深度学习模型以减少技术假象造成的假阳性提高短读长scRNA-seq数据中融合检测的准确性但它对中低表达基因和罕见融合事件的灵敏度仍然有限且依赖短读长数据也限制了对全长融合转录本结构的表征。相比之下长读长RNA-seq能解析融合转录本完整的外显子-内含子结构实现对融合事件及其功能后果的精细分析。将单细胞分辨率的融合转录本分析与体细胞变异整合长读长scRNA-seq有望更有效地揭示人类癌症的细胞异质性和克隆结构。06非多聚腺苷酸化RNA非多聚腺苷酸化RNA——包括转运RNAtRNA、小核仁RNAsnoRNA、小核RNAsnRNA、环状RNAcircRNA、微小RNAmicroRNA以及部分长非编码RNAlncRNA——构成了转录组中一大片庞大而多样的区域。这些RNA长期以来一直逃逸于依赖oligo-dT捕获poly(A) mRNA的常规scRNA-seq方法之外。多种全RNA单细胞测序方法被开发出来以实现poly(A)和非poly(A) RNA的全长覆盖SUPeR-seq使用锚定随机引物同时捕获poly(A) RNA和环状RNAMATQ-seq结合随机引物和oligo-dT引物配合UMI进行全RNA分析RamDA-seq通过随机置换扩增实现poly(A)和非poly(A)转录本的全长覆盖Smart-seq-total通过酶促poly(A)加尾改造Smart-seq2流程使其能捕获非poly(A)转录本VASA-seq在逆转录前对所有RNA分子进行片段化和多聚腺苷酸化处理提供均一、全长覆盖的总RNA谱并支持高通量单细胞的poly(A)和非poly(A) RNA联合分析。这些方法共同推动了我们对非poly(A) RNA物种及其相关调控过程如环状RNA生物发生、递归剪接的理解。但它们仍依赖短读长和转录本组装并未直接端到端测序非poly(A) RNA——未来仍需要一个兼容总RNA的长读长scRNA-seq平台来完整捕获非poly(A)转录组的全长视图。07RNA修饰RNA分子上装饰着超过170种不同的化学修饰包括5-甲基胞嘧啶m⁵C、N1-甲基腺嘌呤m¹A、假尿苷Ψ和N6-甲基腺嘌呤m⁶A它们共同构成了被称为表观转录组epitranscriptome的复杂转录后调控层。其中m⁶A是真核mRNA中最丰富的内部修饰在RNA加工和调控的多个方面发挥核心作用。单细胞m⁶A图谱主要来源于几类短读长scRNA-seq策略对汇集的带条码单细胞或皮克级输入进行m⁶A修饰RNA片段的免疫沉淀原位转座标记与m⁶A抗体结合的RNA通过RNA编辑酶-m⁶A读码蛋白融合蛋白APOBEC1-YTH在m⁶A位点附近催化产生的特征性C到U突变来检测。这些策略揭示了发育调控和细胞类型特异性的m⁶A程序但由于依赖对RNA片段的短读长测序无法将m⁶A位点定位到全长转录本中的具体位置。近期突破——m⁶A-isoSC-seq结合基于10x的Oxford Nanopore长读长与Illumina短读长scRNA-seq通过长读长检测APOBEC1-YTH催化的C到U突变实现了单细胞中m⁶A位点的isoform分辨率图谱绘制。该方法揭示了广泛存在的isoform和细胞类型特异性m⁶A甲基化并将错误加工转录本isoform上的m⁶A标记与RNA降解联系起来。这一框架有望进一步拓展到其他RNA修饰甚至RNA-RBP相互作用组、mRNA翻译组的isoform分辨率、单细胞图谱绘制。08免疫组库T细胞受体TCR和B细胞受体BCR的免疫组库是适应性免疫应答的核心。TCR和BCR的多样性通过多层次过程产生包括V(D)J重组、体细胞超突变和类别转换重组赋予精确的抗原识别能力塑造健康和疾病状态下的免疫功能。大量工作已致力于开发和应用从scRNA-seq数据进行免疫组库分析的计算工具其中大多数基于短读长测序。虽然这些工具主要重建互补决定区3CDR3但更先进的工具如TRUST4能够从短读长scRNA-seq数据组装更长甚至全长的受体序列。近期研究开始展示长读长scRNA-seq在免疫组库分析中的价值。为获得足够覆盖有研究结合杂交捕获与长读长scRNA-seq实现了单细胞TCR和BCR序列的全长分析。将长读长免疫组库数据与基因型、转录组、免疫表型数据整合分析也开始显现价值例如将单个B细胞及其相关BCR序列与供体特异性、单倍型解析的种系基因组进行匹配的长读长scRNA-seq分析实现了从头抗体发现结合TCR序列、体细胞变异和转录本isoform的多维度单细胞分析为白血病中肿瘤和免疫细胞的协同演化提供了新见解。Isoform分辨率scRNA-seq的新维度随着单细胞和长读长技术的持续成熟isoform分辨率scRNA-seq正从单一技术手段扩展为跨越多个新维度的强大工具逐渐成为通过转录组调控视角揭示基因型-表型关系的利器01空间维度在组织背景下绘制isoform多样性细胞身份和功能受空间背景的塑造在组织内绘制isoform多样性能将局部微环境和细胞邻域与RNA调控程序联系起来。基于短读长的空间转录组学技术如Patho-DBiT、Stereo-seq V2实现了更均匀的基因体覆盖和全面的转录本捕获使复杂组织中可变剪接和核苷酸分辨率变异的空间分析成为可能。与此同时空间分辨率isoform测序将长读长测序应用于空间条码化的组织切片在人类和小鼠大脑中揭示了脑区和细胞类型特异性的转录本isoform。配套的专用计算工具SPLISOSM空间isoform统计建模也已被开发出来用于分析isoform分辨率空间转录组数据。02多组学维度将isoform与调控图谱联系起来全面理解基因调控需要在基因组变异、染色质特征、蛋白丰度和代谢状态等多重调控层面上解析转录组多样性这推动了整合性单细胞多组学方法的发展。早期单细胞多组学技术局限于测量总基因表达而新方法如scONE-seq能生成跨越整个基因体的短读长RNA-seq数据提供isoform层面的信息。结合长读长转录组学的单细胞多组学方法也在涌现GoT-Splice基因型-转录组-剪接结合长读长scRNA-seq实现体细胞突变、转录本isoform和表面蛋白的多组学谱分析已被用于将细胞类型特异性体细胞突变与克隆性血液疾病中的异常RNA剪接联系起来。ScISOr-ATAC将长读长scRNA-seq与染色质可及性谱分析结合实现染色质状态和全长转录本isoform的单细胞多组学分析揭示了染色质和转录组调控可以随细胞状态而耦合或解耦。03扰动维度将基因编辑与isoform结果关联起来以CRISPR筛选结合scRNA-seq为代表的大规模平行遗传扰动筛选是因果性解析基因表达调控逻辑的强大策略。经典方法如Perturb-seq使用短读长scRNA-seq测量总基因表达但不具备isoform分辨率。通过将CRISPR基因组编辑与长读长scRNA-seq结合近期研究直接定义了特定工程化突变如何改变可变剪接和全长转录本isoform。随着遗传扰动和长读长scRNA-seq工具箱的持续扩展这一策略将支持对调控可变剪接和isoform表达的顺式与反式调控机制的大规模正向遗传学分析。例如靶向RNA的CRISPR-dCas13d系统可以结合长读长scRNA-seq读出通过单细胞筛选鉴定剪接调控元件并定义其转录本后果。04群体维度将isoform调控与遗传变异联系起来遗传变异对RNA加工和调控具有广泛影响数量性状位点QTL分析为将这类变异与分子及个体表型关联起来提供了框架。群体规模的表达和RNA加工QTL分析传统上在bulk组织中进行而单细胞转录组QTL研究正开始提供更精细、细胞类型分辨的群体内转录组变异视图。例如一项针对474名亚裔供体外周血的群体规模短读长scRNA-seq研究发现了广泛存在于可变剪接中的遗传变异且大多数效应具有细胞类型特异性这些结果也有助于解释一系列疾病尤其是自身免疫和炎症性疾病的全基因组关联研究GWAS信号。作者预计群体规模的长读长scRNA-seq研究将为转录组变异的遗传结构和表型影响提供更深入的洞察尽管测序成本和组织可及性仍是主要瓶颈。人工智能维度用机器学习解读isoform变异机器学习和人工智能的进展正在改变我们分析和解读isoform变异的方式。尽管可变剪接和isoform变异的AI模型传统上基于bulk RNA-seq数据训练但isoform分辨率scRNA-seq及单细胞多组学数据集的不断积累将推动能够纳入细胞类型背景及其他调控层信息的新型AI框架的开发。作者展望这些数据最终将催生预训练的单细胞isoform变异基础模型foundation model。从概念上讲这类AI模型将充当isoform调控的知识库可针对多样化的下游分析任务进行微调将isoform多样性与调控回路、细胞功能和疾病机制联系起来。总结与展望Isoform分辨率转录组学的历史可以追溯到高通量基因表达谱分析的早期阶段当时剪接图splicing graph数据结构和isoform丰度估计的概率框架正是基于表达序列标签EST数据首次开发出来的。随着转录组学和单细胞技术的近期突破isoform分辨率单细胞转录组学已经大大推进了我们对转录组复杂性和细胞异质性的理解。临床应用正在多个疾病领域尤其是癌症和遗传性疾病中逐渐涌现。随着转录组学在未来十年持续向长读长平台转型长读长scRNA-seq有望成为生物医学研究中的重要工具——isoform分辨率单细胞转录组学正在成为理解基因调控、阐明疾病机制、推动精准医学的基石。瑞兴生物已构建成熟的一站式单细胞三代全长转录组解决方案依托ONT平台从实验设计、测序、数据质控与深度挖掘到机制解析与功能验证助力科研团队从转录本层面深入解析疾病发生机制加速高水平成果产出与转化应用。