做Bromodomain这类“溴结构域”蛋白的功能研究最怕的是什么不是敲低效率不够也不是质谱灵敏度不够而是你没法在活细胞状态下、不破坏蛋白天然构象的方式把蛋白“正在发生的结合”给抓拍下来。活性探针策略就是为了解决这个问题而存在的一类方案。我最早接触“活性探针”这个概念时也以为是普通的化学标签偶联后来真正把探针设计、全细胞标记、光交联、点击化学、富集、定量质谱这一整条链路走完才发现它其实是一门“化学生物学”的工程学——每一步都有取舍每一个参数都影响最终能鉴定到多少真实互作。这个项目所做的事情本质上是给Bromodomain蛋白配一把能在活细胞中工作的“分子手铐”探针一端模仿天然配体即乙酰化赖氨酸周围的一段结构另一端连着光反应基团和报告标签。当探针进入细胞与目标Bromodomain结合后用紫外光照一下光反应基团瞬间把探针和附近的蛋白“锁死”在一起之后再加点击化学试剂接上生物素就能把感兴趣的复合体从复杂的细胞裂解液里“钓”出来送去做质谱鉴定以及后续功能实验。这套流程尤其适合研究溴结构域蛋白与组蛋白修饰位点之间的动态识别、蛋白复合物构成变化以及识别异常导致的疾病机制。对于正在设计化学探针、希望深挖表观遗传“阅读器”功能的同行来说这篇文章可以当作一条已经跑通的实验思路参考。1. 为什么要给“溴结构域”配一把活性探针1.1 Bromodomain是表观遗传修饰的“阅读器”Bromodomain是一段大约110个氨基酸的保守结构域最早在果蝇 Brahma 基因中发现后来在人类蛋白质组里发现了几十个成员。它的核心功能是识别蛋白质上被乙酰化的赖氨酸残基尤其是组蛋白尾巴上的乙酰化位点。我们总说表观遗传调控有“书写器”“擦除器”和“阅读器”Bromodomain就是典型的“阅读器”身份它本身不会加上乙酰基也不会去掉乙酰基而是通过一个相对比较浅的疏水口袋把乙酰化赖氨酸残基“读”进来然后把效应蛋白招募到特定基因位点最终激活或抑制转录。这里有一个容易被忽略但至关重要的特点Bromodomain识别乙酰化赖氨酸的亲和力普遍不高。单个溴结构域与单乙酰化位点的解离常数往往在几十微摩尔到几百微摩尔级别这种“弱相互作用”在生物体内其实是刻意设计的结果——只有多种信号同时汇聚才能形成稳定复合体。可到了我们做功能研究时它就成了麻烦。普通免疫沉淀靠抗体拉蛋白抗体识别的是线性表位拉下来的产物往往丢失了原先活细胞里的动态结合状态而如果直接做核抽提、盐浓度梯度分离又会破坏弱相互作用。所以我们必须换一种思路在蛋白还“活着”的时候就让它自己和它的邻居发生“化学交联”把弱互作固定下来。这正是活性探针最大的优势。1.2 蛋白组学时代更需要“原位抓拍”传统功能研究喜欢做“基因干预”把某个Bromodomain敲低再观察转录组或者细胞表型变化。这个方法当然有用但是它是间接的。敲低某个蛋白后细胞会启动大量补偿机制你所观察到的下游变化可能并不是蛋白直接结合的产物而是一层层信号通路反馈叠加后的结果。想要得到蛋白最直接的功能证据最好的办法是知道它在特定时间点、特定细胞状态下到底结合在哪些基因组位点、和哪些蛋白在同一个复合体里。ChIP-seq可以解决DNA结合位点的问题但它需要抗体而且抗体质量会极大影响结果BioID邻近标记可以解决蛋白互作问题但它需要把诱饵蛋白融合到生物素连接酶上等于给蛋白加了一个额外的大标签并不适用于所有场景尤其是需要保留内源蛋白天然表达水平的情况下。相比之下基于活性探针的小分子化学标记不改变目标蛋白的氨基酸序列也不依赖抗体识别而是通过小分子配体与靶蛋白表面的口袋结合尽量保留内源构象和翻译后修饰状态。这一点对于研究Bromodomain这类“蛋白-蛋白互作界面浅而平”的分子尤其关键。1.3 活性探针与抗体、过表达体系的本质差异很多人会把“活性探针”和“带荧光的抑制剂”混为一谈。荧光抑制剂只能告诉我们“探针在哪里结合”不会告诉我们“探针结合的蛋白周围还有谁”。活性探针策略的实质是“配体引导的原位交联”所有与探针结合的蛋白一旦经紫外光激活探针上的光反应基团就会形成高活性中间体把探针与结合蛋白共价连接起来。然后再通过点击化学接上生物素或其他可分离标签使富集过程不依赖靶蛋白本身的表达量。用抗体做免疫沉淀时抗体本身结合在靶蛋白的某个表面区域可能遮挡了与其他蛋白的互作表面而活性探针结合在天然配体结合口袋上这个口袋本来就是蛋白发挥功能时的核心界面探针分子正是从那里“挤进去”的。因此探针捕获到的互作信息更接近真实功能状态下的互作信息。当然这也意味着探针设计如果选了一个非功能构象或者结合口袋偏离了真实界面实验结果就会被带偏所以探针骨架的选择和后续竞争性对照缺一不可。2. 探针设计与合成三个模块一个核心2.1 从已知配体骨架出发保留结合亲和力设计溴结构域活性探针首先要选定一块“骨架”分子。这块骨架必须是在体外活性实验里证明过、能够与目标溴结构域口袋良好结合的配体。对于BET家族来说公开文献中已经有很多成熟的抑制剂骨架它们通常由乙酰化赖氨酸模拟片段和一个疏水取代基组成。你需要根据课题目标选择如果研究的是BRD4可以从BET抑制剂骨架出发如果要研究的是CBP/p300的溴结构域则需要使用另一类反式酰胺类骨架。关键点在于骨架和待研究蛋白的亲和力必须足够强通常需要IC50在100纳米摩尔以下或者解离常数Kd在几十纳摩尔级别。这个数字直接决定了后续探针能否在纳摩尔浓度下特异性标记靶蛋白。如果骨架本身亲和力只有微摩尔级那探针在细胞里的使用浓度就要提得很高高浓度带来的非特异吸附会严重干扰质谱结果。所以在实际工作中我们一般会先通过表面等离子共振或热位移分析把几个候选骨架的亲和力重新测一遍再进入探针改造。2.2 光反应基团光亲和标签怎么选探针分子除了骨架之外第二个必须的模块是光反应基团。常用的是双吖丙啶、二苯甲酮和芳基叠氮。我自己的实际使用经验里双吖丙啶是最省心的选择。它分子量小对骨架的亲水性影响相对较小紫外光激活温度约365纳米比较温和二苯甲酮虽然也能用但激活波长偏长某些情况下有利可是体积较大容易改变整个探针的溶解度和穿膜性芳基叠氮虽然容易合成但光解后产生的反应中间体稳定性稍差在富集过程中经常出现背景升高。要注意光反应基团不能放在与靶蛋白结合面冲突的位置。通常的做法是把它放在骨架的溶剂暴露端或者连接臂的远端。你可以通过预测晶体结构或者已知共晶结构来判断哪个位置允许修饰。如果不做结构模拟就得多试几组修饰位点挑一个被标记效率最高的位置。这一步往往比后面所有步骤都耗时因为“骨架能不能结合”和“结合之后能不能交联”是两回事。2.3 报告基团与连接臂长度和极性的权衡探针第三个模块是报告基团几乎所有蛋白质组学实验都会用到生物素。生物素和链霉亲和素的结合极其稳定可以在变性条件下进行富集把非共价互作洗掉只留下共价交联的复合物。但在活细胞标记那一步直接带生物素的探针往往膜穿透性很差而且会干扰小分子在细胞内的分布。所以更常见的策略是设置一个“正交报告基团”比如末端炔基。标记完成后细胞裂解液再与生物素-叠氮化物进行点击化学偶联。这样就把“小分子探针进细胞”和“生物素化富集”两个步骤解耦整体信噪比好很多。连接臂的长度也很讲究。连接臂太短可能在空间上阻碍光反应基团与附近蛋白接触导致交联效率低连接臂太长又可能让探针变成“钓鱼线”把大量非特异性蛋白缠进来。不同实验室有不同偏好但普遍可接受的是PEG类连接臂比如三甘醇或四甘醇同时提供亲水性和一定的柔性。我的个人习惯是先做2到3个不同连接臂长度的变体在裂解液里做一轮简单的竞争实验观察哪个变体在竞争性抑制剂存在下信号消失最干净就以它作为最终探针。2.4 一个典型探针的合成路线参考这里给出一套已经相当成熟的简化合成路线供有合成经验的同行参考。需要强调具体路线取决于骨架官能团的位置以下只是一个通用的改编思路骨架分子上先引入一个羟基或氨基作为修饰位点。通过酰胺偶联或醚化反应接上含叠氮或炔基的连接臂。再接一个含双吖丙啶的小分子片段最好通过一个短酯键或酰胺键连接到连接臂末端。最后用高效液相色谱纯化用质谱和核磁氢谱确认结构测定纯度一般要求纯度高于95%。合成完成后不要急着进细胞实验先做一轮体外光交联预实验纯化目标溴结构域蛋白加入探针365纳米紫外灯照射十分钟再用SDS-PAGE和凝胶内荧光扫描观察是否有共价迁移条带。如果探针只与靶蛋白孵育而不照光则没有共价产物这个阴性对照非常重要。3. 活细胞标记与蛋白质组学鉴定流程实录3.1 细胞培养、给药与最佳交联时间窗细胞实验的第一步是确定探针进入细胞后的结合平衡时间。不同探针的膜渗透性差异很大一般推荐做一个时间梯度从15分钟到2小时固定浓度然后在细胞裂解液里直接跑蛋白免疫印迹检测靶蛋白是否被生物素化。这里有个容易被新手忽略的细节探针通常用DMSO溶解加到培养基里的时候DMSO终浓度不宜超过0.1%否则细胞状态会受影响同时要保证血清对探针的影响可接受最好用无血清培养基或者低血清条件孵育。我常用的做法是接种适量细胞于10厘米皿中待细胞密度达到70%至80%时换上新鲜培养基加入探针至预设浓度。一个参考起点是1微摩尔探针37摄氏度孵育1小时。之后立即放置于冰上吸掉培养基用预冷PBS洗两次再进行紫外照射。这里有一个核心原则从加探针到紫外光照的过程中细胞始终处于正常生理状态只有到了“抓拍”那一刻才用紫外光把蛋白复合体定格。紫外照射前细胞不要经过任何裂解、洗涤太多次、固定等干预否则弱互作可能已经丢失。3.2 紫外光交联的关键参数紫外光交联看似简单实际上参数敏感。大多数双吖丙啶探针的最佳激活波长为360到380纳米可以用普通的手持式365纳米紫外灯但要注意光强和照射距离。细胞培养皿建议放在冰上光源距离细胞表面约5厘米左右照射时间通常5到15分钟。照射时间过长会造成蛋白氧化损伤交联背景增高照射时间过短一部分探针分子没有被激活标记效率下降。最好用照度计测一下到达细胞面的功率密度标准化的功率密度比单纯时间更可靠。我踩过最大的坑是实验室里的紫外灯用久了光衰严重还按老时间照射结果探针标记效率直线下降。后来养成习惯每半年标定一次紫外灯输出并在每次实验时记录实际功率。这个细节救了不少后续实验。紫外照射结束后细胞需要刮取并收集到离心管中。先用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液或细胞裂解液提取总蛋白这里注意裂解液里不要含有还原剂和叠氮化物会干扰后续点击化学反应。裂解后可以进行超声或反复冻融辅助碎裂但过程要温和尽量避免蛋白变性过度。3.3 点击化学偶联报告基团裂解液中的蛋白浓度需要先定量常见方法有BCA法。随后取总蛋白约1到2毫克用于点击化学反应。这一反应的基本条件是铜离子催化剂、配体如TBTA或THPTA、还原剂如TCEP以及生物素-叠氮化物。如果探针端是炔基报告分子就是叠氮-生物素反过来如果探针端是叠氮报告分子就是炔基-生物素。反应通常在室温进行1小时。我强烈建议多做一组“无铜离子”的阴性对照体系里不加铜催化剂只加探针处理过的裂解液和生物素试剂。如果这一组信号很高说明探针或蛋白本身有非特异的生物素化吸附需要优化洗涤条件。点击化学的整体效率通常不低但蛋白浓度过高或者还原剂过量都会抑制反应所以需要严格按照推荐的摩尔比例进行。反应完成后需要去除多余的游离生物素试剂。可以采用脱盐柱、超滤管或直接加入大量体积的裂解缓冲液进行稀释。无论如何要确保后续链霉亲和素富集步骤中体系里没有大量游离生物素去竞争结合位点否则回收效率会断崖式下降。3.4 亲和富集与蛋白酶解链霉亲和素磁珠或琼脂糖珠都可以用于富集生物素化蛋白。把点击反应产物与磁珠在4摄氏度旋转孵育过夜或至少4小时让生物素和亲和素充分结合。然后依次用高盐、低盐、去污剂和尿素等缓冲液洗涤磁珠以去除靠着疏水作用或离子作用非特异吸附的蛋白。富集后的蛋白可以进行两种后续处理一是直接在磁珠上进行蛋白酶解用胰蛋白酶或LysC切割后收集肽段二是先用加热和还原烷基化处理洗脱蛋白再酶解。我倾向于直接在磁珠上酶切因为可以减少样品损失但要注意磁珠本身可能产生聚合物污染影响质谱。肽段经过脱盐后即可交给液相色谱-串联质谱。数据采集可以用数据依赖模式也可以用数据非依赖模式。由于这个实验往往在同一批样品中比较不同处理组的蛋白丰度建议使用TMT或SILAC等定量标记策略。如果实验室条件不允许用label-free定量也可以但重复数至少要三组生物学重复否则统计功效不足。3.5 质谱鉴定与竞争性对照这是整个实验最核心的数据质控阶段。不能只看“探针组鉴定到哪些蛋白”必须同时做一个竞争性对照组在不改变探针浓度的前提下额外加入过量通常为探针浓度的10倍到50倍的备用竞争性抑制剂。竞争性抑制剂和探针结合同一个口袋因此在结合阶段就能把特异性靶蛋白的探针结合位点抢掉。如果在竞争组中某个蛋白的富集量显著下降那它才是真正的特异性结合蛋白那些在两组中都出现且丰度没有差异的蛋白基本可以归为非特异背景。比较常见的数据处理策略是设定差异倍数阈值比如竞争组信号相对于探针组下降至30%以下同时显著性P值小于0.05才认定为候选靶点。同时还要留意肽段数量至少对应两个以上特异性肽段且总肽段数在三次重复里保持稳定。单个肽段鉴定出的蛋白一般不作为优先验证对象。4. 从“捕获名单”到功能机制的延伸验证4.1 用竞争性实验圈出特异性结合蛋白拿到质谱列表后第一步是看“最大的特异性信号”。通常靶蛋白本身会排在列表前面因为探针就是为它设计的。但这不是终点。有时候你会发现某些之前从未报道过的蛋白也进入特异结合名单。这时候需要小心它们可能是通过靶蛋白与探针-靶蛋白共价复合物间接被交联上的也可能是靶蛋白复合体内的伙伴这本身就是很有价值的信息。要对这些蛋白进行通路分析看它们是否富集在转录调控、染色质重塑、RNA剪接等已知功能模块中。从我这里过往的经验来看Bromodomain探针最常捕获的“额外蛋白质”有两类一类是溴结构域所在的转录共调节复合体成员另一类是乙酰化蛋白本身比如组蛋白。后者的存在其实说明探针与DNA上的乙酰化标记也在发生作用这是值得深挖的线索。可以继续做ChIP-qPCR看该Bromodomain是否被这些乙酰化位点招募到特定基因启动子上。4.2 突变体与“丢失信号”实验质谱的结果只是相关性要获得因果证据需要使用溴结构域关键氨基酸突变体来验证。一般认为Bromodomain口袋中存在一个高度保守的天冬酰胺残基它与乙酰化赖氨酸形成关键氢键。把这个天冬酰胺突变为异亮氨酸或其他不带氢键供体的氨基酸会严重破坏乙酰化赖氨酸的识别。如果突变后原本能被探针捕获的互作蛋白信号显著丢失说明这些蛋白的装配确实依赖于完整的溴结构域口袋。具体操作可以在细胞中转染带有tag的野生型或突变体溴结构域蛋白然后用活性探针处理细胞并富集最后通过免疫印迹检测特定候选蛋白是否被共纯化。另一种更直接的做法是在基因组位点进行碱基编辑引入突变但这需要更长的周期。突变体验证可以和“竞争性抑制剂处理”结果相互印照如果竞争性抑制剂能够阻断互作而关键的溴结构域突变体同样阻断互作那么结论就相当牢靠。4.3 从蛋白互作到转录调控的闭环互作数据最终要落到功能上。Bromodomain蛋白最重要的一类功能是影响基因转录。当鉴定到一个候选靶蛋白并且确认它和某个溴结构域蛋白直接或间接结合后可以继续做转录组下的差异分析用竞争性抑制剂处理细胞或敲低靶蛋白观察哪些基因的表达变化与互作蛋白的结合位点相关。我常常建议做“三步闭环”第一用活性探针结合定量质谱找到候选互作蛋白第二用竞争性抑制剂或突变体确认互作依赖完整的口袋结构第三用RNA-seq或RT-qPCR看在抑制这个口袋结合后相关目标基因的转录是否像预期一样上调或下调。三步做完一条从“小分子结合”到“基因表达调控”的功能链就完整了。对于BRD4这类参与超级增强子调控的蛋白这种策略还可以进一步延伸到相分离机制的讨论中当然那需要更高级的成像和生物物理学辅助。4.4 一个虚构案例BD-X的研究路径为了便于理解我们虚构一个名为BD-X的溴结构域蛋白假设它在某类肿瘤细胞中高表达。我们用活性探针处理细胞后质谱结果显示与BD-X共交联的蛋白里有一个转录因子TF-Y显著富集而且这种富集能够被竞争性抑制剂浓度依赖性抑制。随后我们将BD-X的天冬酰胺保守位点突变为异亮氨酸TF-Y的共纯化信号基本消失。最后我们在BD-X敏感细胞系中用竞争性抑制剂处理后做RNA-seq发现下游一组与细胞周期相关的基因发生了明显下调TF-Y的ChIP-seq在启动子区信号也随处理发生改变。这三组实验结果放在一起基本可以回答“BD-X蛋白通过其溴结构域识别乙酰化标记来招募TF-Y并协同调控特定基因转录”这一功能假说。这个例子里的每一步都可以被单独设计成验证实验整体路线是通用的。5. 常见问题与排查技巧实录5.1 探针标记效率低、富集不到靶蛋白经常有人问我“明明质谱结果里大背景很多可就是看不到目的蛋白怎么办”我一般先让他做三步排查第一验证探针本身与纯化靶蛋白的结合做一个体外光交联实验排除探针设计错误第二验证细胞是否摄入探针这可以通过带荧光基团且可显微成像的探针变体来看若信号在细胞内清晰可见说明摄入没问题第三检查紫外光功率这是最容易出问题的一环。根据经验很多“标记效率低”的案例最后都是紫外灯光衰或者照射距离拉太远导致的。另外还要留意探针储存条件。含光亲和标签的探针要避光、低温保存长期暴露在普通照明光下会让光反应基团提前分解。用棕色玻璃瓶分装并在-80度保存相对最稳妥每个小份只取用一次不能反复冻融。5.2 背景蛋白太多非特异吸附严重背景蛋白多的罪魁祸首通常不是“探针结合太多”而是“富集洗得不狠”。链霉亲和素磁珠表面会有非特异吸附尤其是高丰度蛋白如角蛋白、核糖体蛋白、热休克蛋白。可以做一个简单的检测不加探针只加生物素试剂和磁珠看质谱里有哪些蛋白这些就是系统背景。要压低背景建议在裂解液中加入0.5%到1%的NP-40或Triton X-100并尝试增加一个“预清除”步骤先将不含生物素的磁珠与裂解液预孵育1小时吸走上清后再进行正式的生物素化蛋白富集。如果背景还是高可使用含有0.5M氯化钠和1%去垢剂的高严紧洗涤液冲洗磁珠然后再用含2M尿素的洗涤液洗一次。大多数非特异性相互作用可以被这两步洗掉但要注意不要过度冲洗导致真实弱互作信号丢失所以每次实验都要保留一个“阳性竞争对照组”来标定洗涤强度是否合适。5.3 质谱鉴定的肽段覆盖率低覆盖率低往往是因为交联后的靶蛋白分子量偏大或者交联位点附近的肽段无法用常规胰蛋白酶酶切。另一个原因是富集后的蛋白量太少。可以考虑在磁珠酶解前先做一次SDS-PAGE分离将蛋白样品短跑胶至进入分离胶约1厘米然后进行胶内酶切这样能有效去掉小分子污染和脂类同时富集肽段。也可以用多酶联合消化策略比如先用LysC在37度酶切3小时再补胰蛋白酶继续酶切过夜。这样对膜蛋白或大蛋白的肽段鉴定率有明显改善。如果靶蛋白丰度确实很低可以尝试扩大起始细胞量。通常一个10厘米皿细胞的总蛋白量约为1到3毫克如果靶蛋白表达量低需要合并3到5个皿的样品。同时也可以使用抗靶蛋白的抗体在点击化学富集后进行二次免疫沉淀把目标复合体进一步纯化这一步叫“串联系纯化”。5.4 竞争性对照组信号不减反增这是一个很有意思的场景某些蛋白的信号在加了竞争性抑制剂后不仅没有下降反而升高。这种“抑制诱导的富集”不一定是实验错误有可能是竞争性抑制剂引起的细胞应激反应导致该蛋白表达量上调。为了区分可以在竞争组中加入等量但无活性骨架的阴性化合物即“无效类似物”如果信号在无活性类似物组中也升高那多半是化合物本身毒性和细胞应答造成的不是特异性事件。另外竞争性抑制剂的浓度过高会产生off-target效应它可能把其他Bromodomain也全部抑制导致你的靶蛋白被间接影响。推荐做浓度梯度比如探针浓度的5倍、10倍、20倍观察信号变化是否符合剂量效应。只有剂量依赖性抑制才足以说明结合特异。5.5 操作员经验几个小习惯决定结果成败这个流程里很多看似无关紧要的小细节最终能决定实验是否漂亮。第一细胞加探针前至少换一次新鲜培养基因为旧培养基里的代谢物可能跟探针发生反应第二紫外照射时一定要将培养皿放在冰上不要让细胞过热否则蛋白会发生大量聚集第三裂解液里不能含有DTT或β-巯基乙醇因为还原剂会淬灭铜催化点击化学反应第四生物素化蛋白富集之后所有后续洗涤液都要快速预冷动作要快防止蛋白酶降解。我最想强调的还是“对照组永远不要省”。哪怕只是快速做一个无竞争性抑制剂的简单预实验也要尽量保留至少一个阴性对照和一个竞争性对照。没有对照的活性探针实验质谱结果基本不具备说服力有了对照即使出现意外也能帮你判断是数据可靠但机制复杂还是实验本身就出了问题。6. 这套流程还可以往哪些方向延伸活性探针策略能做的事情其实不止“抓互作”。如果给探针加上一个可在细胞内反应的基团比如能够形成共价键的亲电弹头那它就从“光交联探针”升级成“共价抑制剂探针”可以直接用来追踪靶蛋白在不同药物处理下的表达量和翻译后修饰变化。这类探针正越来越多地被用于药物靶点验证和耐药机制研究。对于Bromodomain蛋白而言我认为最值得投入延伸的方向是“时间和空间分辨标记”。现在很多传统探针只能做一个时间点的“平均”信号但如果把光交联技术与活细胞荧光成像结合就可以研究蛋白复合体在转录激活过程中如何动态聚集和分离。比如可以在特定细胞周期阶段开启交联然后用质谱看看不同阶段互作组的变化。这种实验虽然难但一旦做出来对功能机制的解释会非常有冲击力。此外如果课题方向涉及小分子药物筛选活性探针还可以变成“竞争性筛选”的工具用固定浓度的探针标记细胞提取物检测不同候选化合物对靶蛋白标记的抑制程度。相比传统放射性配体结合实验这种方法不需要特殊防护而且能同时读出靶蛋白和互作蛋白的变化很适合做初筛。我个人的体会是活性探针与其说是一个成熟流程不如说是一套思维框架——它把“结合”“互作”“功能”这三件事用化学交联的方式串了起来。你只要把探针设计好、对照做扎实后续能延伸出来的功能验证方案往往比你自己一开始预想的还要多。