上篇文章我们介绍了mIHC/IF图像分析的基本操作包括图像采集、颜色反卷积、光谱拆分、组织及细胞分割、表型判断及算法验证等。点击阅读本文将继续探讨图像标注、批次间校正、配准以及原始数据输出、核心分析程序与源代码、代表性显微图像的共享建议。五、图像标注我们在完成图像处理后可以对特定区域进行筛选并进行标注结果分析纳入或排除。我们可以绘制不同组织区域、分区边界也可以标记特定的解剖结构如三级淋巴样结构、肿瘤微环境区域等。标注策略需要预先设定且同一研究队列中的全部样本应该保持一致。为保证一致性建议有专人完成全部标注工作或由同一人核查所有标注。目前有些算法或AI能自动屏蔽组织撕裂、褶皱或其他伪影用于筛选目标结构有助于提高分析通量。标注工具用于肿瘤微环境区域筛选。A蓝色线条勾勒出肿瘤结节B黄色线条划定纳入分析的TME区域排除上层表皮内的黑色素瘤区域六、跨批次归一化mIHC/IF信号存在批次间差异需要进行跨批次归一化处理。试剂更换或性质改变仪器不同运行批次或重新校准都可能会造成信号差异。消除批次间染色信号差异可采用图像分析策略。理想情况是在细胞分割及表型鉴定之前完成图像校正但由于分析软件的设置通常是在其后才能进行批次校正。研究发现为实现可靠的校正结果建议至少使用10种不同的对照组织组织微阵列TMA适用。TMA纳入多种不同类型组织其连续切片可提供一致的对照数据和每一批待分析切片同步完成染色和成像。通过量化各批次间标志物表达信号的差异实现归一化。mIHC/IF图像采集时常选择多个高倍镜视野进行图像拼接。为生成信号均匀、拼接无缝的全切片图像需要进行校正比如平场校正、镜头校正、曝光时间校正等也可以通过算法实现图像校正处理。用于染色优化与图像处理、生成高质量数据集的AstroPath平台七、图像配准单切片多重免疫组化连续染色MICSSS、组织循环免疫荧光t-CyCIF或其他mIHC/IF技术都需要图像配准。图像配准可对同一种切片进行重复成像也可分析同一样本的连续切片。两种方式分别搭建不同的标志物组合或实现肿瘤三维重建提升检测的多重指标通量。在同一张切片上重复进行“染色-洗脱”每完成一次免疫染色后对切片进行扫描。在将切片放入扫描架时会存在微小位置偏差导致不同图像中的组织坐标发生变化造成图像在显微尺度下出现组织形变与位移使得同一感兴趣区ROI统计得到的总细胞数量存在差异。通过尺度不变特征转换SIFT、加速稳健特征SURF、定向FAST、旋转BRIEF等算法实现图像对齐。Fiji的TrakEM2插件支持自动图像配准将同一张切片上不同标志物对应的全部细胞校准至统一坐标。对同一组织块的连续切片分别染色也可以提高mIHC/IF检测的多重指标通量。连续切片配制通常将两张切片纳入同一坐标系基于互相关函数最小化的算法校正图像间的差异。图像配准结果。A在多张连续切片上开展三种不同标志物的IHCB各独立图像合并为多组分合成图像。约翰霍普金斯大学的研究团队借助天文成像分析技术开发了一个肿瘤切片分析平台AstroPath。相较于IHC和肿瘤突变负荷mIF/mIHC测量对免疫应答有更高的预测准确度但在图像和数据处理方面面临诸多挑战尤其在分析面积较大的肿瘤切片时。研究团队发现用天文望远镜观察星系和用显微镜观察细胞的成像分析非常相似于是他们借鉴了用于分析1022米尺度星系的图像分割经验对10-6米尺度上的肿瘤病理图像分析进行了改革。AstroPath有助于实现mIF分析流程标准化。首先对测量参数的可靠性进行优化解决荧光信号强度不稳定、显微镜亮度变化、透镜畸变对原位置信号的影响等问题。在图像采集时不完全平场校正会造成荧光强度变化拼接错误也会造成高倍视野HPF错位。他们将每个HPF之间保留20%的重叠图像并用类似光学防抖原理的“弹簧模型”把像素偏移最小化。还对细胞表型进行了多次程序优化比如将单个较大细胞如癌细胞、髓细胞进行多次分割将其记录为多个细胞。作者从样本中抽取约25000个细胞进行验证通过正常组织微阵列进行校准结果大幅降低了mIF研究中的批次差异信号变异度也从11.2%下降至1.2%。AstroPath平台减小视野采集与图像拼接过程中的批次误差八、数据与代码共享识别空间连续区域或邻域是mIF/mIHC图像分析的重点研究方向。大多数统计方法采用全局空间自相关统计识别空间可变表型邻域通过K近邻算法或细胞间最大距离阈值进行界定。部分分析方法还会在细胞区域划分网格以网格为单元作为分析单位而非单个细胞。mIF/mIHC输出的结果包括表格化数据、记录像素和细胞的二维坐标以及细胞、靶蛋白的形态、定位等数据。利用图像分析工具完成细胞分割后会生成一系列指标比如细胞密度、标志物表达强度、目标物间距离、特定肿瘤区域内各标志物占比等。相关算法可通过脚本Python、Julia、R、MATLAB、交互笔记Jupyter、Google Colab或MCMICRO、CytoMAP等工具进行分析。数据经过合规验证并可重复生成可共享数据的结构和管理要求需要形成共识。数据共享要包括图像分析前的原始信息以及缩写对应的释义图像分析完成后、支持论文结论的其它关键数据同样需要提交。图像分析涉及多种算法和模型共享可复现分析结果所需的代码同样重要。代码及其更新版本应具有可读性附带清晰的输入、输出文档说明。研究者可以利用提供的数据完整复现论文中的图表也可使用经过标准化处理的自有数据生成等效图表。无论原始图像是否对外公开我们建议将仪器直接导出的原始图像及配套元数据长期归档保存。参考文献1. Berry et al., Analysis of multispectral imaging with the AstroPath platform informs efficacy of PD-1 blockade. Science 2021. https://doi.org/10.1126/science.aba26092. Taube JM, et al. Society for Immunotherapy of Cancer: updates and best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) image analysis and data sharing. Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2025. doi:10.1136/ jitc-2024-008875