卡梅德生物技术快报｜人源scFv抗体蛋白：人源scFv抗体蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达优化策略

1. 问题提出scFv在大肠杆菌表达中的包涵体困境人源scFv抗体蛋白因分子量小约25-30 kDa、不含Fc糖基化依赖片段理论上可在原核系统——大肠杆菌中实现高效表达。然而实际工作中一个普遍问题是scFv在E. coli BL21(DE3)等常用菌株中诱导表达后大量产物以不溶性包涵体形式沉淀可溶性组分占比低严重影响后续纯化和活性回收。以b12-scFv为例在pET28a载体转入BL21 Star™(DE3)并经IPTG诱导后SDS-PAGE显示表达产物虽然分子量约29 kDa与预测一致但可溶性蛋白与包涵体并存。更典型的场景是原始表达的scFv几乎全部聚集为包涵体需要复杂的变复性流程才能获得活性产物。2. 原因分析为什么scFv容易聚集从分子层面看scFv的聚集原因包括1scFv缺少完整抗体的恒定区框架支撑VH与VL之间的正确折叠完全依赖连接肽的物理连接和分子内相互作用力2VH和VL表面的疏水区域在表达过程中容易暴露若新生肽链折叠速度跟不上表达速度便发生分子间聚集3大肠杆菌胞质内的还原性环境不利于二硫键的正确形成而某些scFv构象依赖链内二硫键维持。3. 解决策略一SUMO标签融合表达SUMOsmall ubiquitin-related modifier融合标签可以显著提高scFv的可溶性表达水平。李镇生等利用SUMO蛋白酶Ulp1高效切割SUMO融合蛋白在N端和C端添加His₆标签构建重组表达载体psvT7-ulp1转入大肠杆菌BL21(DE3)后优化诱导条件Ulp1纯度达95%以上。利用Ulp1切割SUMO融合表达体系成功获得高纯度、可溶性scFv。操作要点将scFv基因构建至pET-SUMO载体中转化至BL21(DE3)在16-25℃、0.1-0.5 mM IPTG条件下低温低速诱导过夜可显著减少包涵体形成。4. 解决策略二响应面法RSM优化表达条件当scFv倾向于形成包涵体时可以通过Box-Behnken设计对诱导温度、诱导时间、IPTG浓度三因素进行系统优化。以anti-MICA scFv为例研究者设计了15个实验组合测定不同条件下可溶性蛋白产量从响应面模型中寻找最优条件。结果显示不同蛋白的最佳条件各不相同但针对anti-MICA scFv最优组合下可溶性产量可达约1.1 mg/mL。关键参数范围参考诱导温度16-30℃低温有利于可溶性折叠IPTG浓度0.05-0.5 mM低浓度降低表达速率诱导时间6-16 h需根据菌株生长曲线调整5. 解决策略三包涵体温和复性在无法避免包涵体生成时温和溶解缓慢柱上重折叠是获得活性scFv的可靠替代策略。具体操作参考α-突触核蛋白原纤维特异性scFv-F的方案采用100 mM TrispH 12.5和2 M尿素的温和条件溶解包涵体然后通过缓慢柱上重折叠法获得活性scFv-F。相比传统的6-8 M尿素或盐酸胍强变性复性温和溶解策略的优势在于保留更多的局部结构信息有利于复性效率的提升。2024年发表的研究也支持排除强变性协议采用温和或自发溶解策略的导向。6. 效果验证数据对比策略代表性scFv优化前状态优化后结果SUMO融合未具名scFv包涵体为主高纯度可溶性表达RSM优化anti-MICA scFv包涵体为主-1.1 mg/mL可溶性产量温和复性α-syn scFv-F包涵体活性蛋白成功获得7. 操作建议针对人源scFv抗体蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达建议按以下优先级逐步尝试1⃣ 优先尝试低温诱导16-22℃ 低浓度IPTG0.1-0.3 mM2⃣ 若效果不佳将scFv基因构建至SUMO或MBP融合载体3⃣ 若仍有大量包涵体采用响应面法系统优化三个关键参数4⃣ 最终方案可接受包涵体表达时采用温和复性策略获得活性产物参考文献[1] 焦子琛等. 单链抗体的新研究进展及其在医学中的应用[J]. 2024.[2] 杨雄等. HIV-1可溶性单链抗体b12-scFv的表达与活性分析[J]. 2014.[3] 可溶性蛋白原核表达全攻略. Nebulabio, 2025.[4] SUMO蛋白酶Ulp1高效表达纯化并通过His-SUMO标签制备scFv. 2023.[5] Gupta V et al. α-synuclein fibril-specific scFv表达、纯化和鉴定. 2020.[6] 包涵体蛋白纯化综述. 2024.