标题DgbHLH2通过激活DgGST的表达来调节菊花中的ROS清除从而正向调节耐寒性DgbHLH2 positively regulates cold tolerance by activating DgGST expression to mediate ROS scavenging in chrysanthemum发表单位四川农业大学刘庆林等教授团队发表期刊Industrial Crops Products影响因子6.2发表时间2026年4月8日研究背景菊花对低温较敏感导致生长发育以及观赏性受影响因此提高菊花的耐寒性对于菊花产业至关重要。植物在感知冷胁迫时会激活下游的信号通路激素信号传导在该胁迫下也起着重要作用随着信号的传递关键转录因子会被激活比如 MYB 和 bHLH 参与调控形成复杂的转录网络进一步诱导寒冷响应基因的激活。冷应激还会导致过量活性氧ROS的积累如 H₂O₂ 和 O₂⁻这会增强脂质过氧化并升高丙二醛(MDA)水平从而加剧膜损伤。为抵御这种氧化应激植物的抗氧化防御系统会被激活包括增强过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽S-转移酶(GST)等酶的活性这些酶能有效清除活性氧、缓解氧化损伤同时通过维持细胞完整性来保持相对电解质渗透率(REC)的稳定。通过这些信号转导、基因调控和生理修复过程植物最终能够适应低温环境。bHLH转录因子在植物冷胁迫响应中起核心作用PpbHLH230介导的PpPOD和PpAPX基因的转录激活提升了抗氧化相关酶的表达和活性并抑制了ROS的积累然而bHLH及其下游相互作用基因在菊花中的抗寒机制仍不清楚。本篇文章发现了一个由寒冷诱导的bHLH转录因子DgbHLH2并证明了它在调节抗寒性方面的积极作用。图DgbHLH2在菊花冷胁迫中的调控模型研究结果结论1——DgbHLH2 位于细胞核中有转录激活活性并且对低温胁迫有反应。作者前期根据菊花低温转录组数据锁定bHLH 家族其中DgbHLH2是所有 bHLH 里上调幅度极高的候选基因。亚细胞定位结果图1a显示其定位于细胞核上进一步证明DgbHLH2是转录因子酵母转录激活实验图1b发现DgbHLH2的N端、C端无转录激活能力中段 134–201 aabHLH 结构域具备转录激活活性可激活下游靶基因具备调控下游耐寒基因的分子基础。DgbHLH2 自身启动子含低温响应元件 LTRE双荧光素酶报告基因与定量分析实验图1c、f结果显示4℃低温处理ProDgbHLH2-LUC 荧光活性显著上调证明DgbHLH2 启动子对低温有响应。qPCR结果图1d、e显示DgbHLH2 表达量茎根即DgbHLH2 主要在叶片发挥功能叶片是低温 ROS 损伤主要部位且4℃处理后DgbHLH2 表达持续上升12 h 达到峰值表明低温显著诱导 DgbHLH2 表达存在时间依赖性。图1(a) 亚细胞定位。 (b) 酵母转录激活实验右侧面板显示用于测试的DgbHLH2片段。(c) 双荧光素酶实验将pGreenII 0800-LUC-ProDgbHLH2载体导入烟草(Nicotiana benthamiana)叶片结果比较对照组(25℃/22℃ 日/夜)与低温处理组(4℃ 4小时)。(d) 组织特异性表达检测定量分析野生型(WT)菊花根、茎和叶中DgbHLH2基因的相对表达水平。数据采用单因素ANOVA和Tukey检验分析(均值 ± SDn 3)。不同字母表示在p ≤ 0.05具有显著差异。(e) 低温处理表达检测定量分析WT菊花叶片在4℃低温处理0、3、6、12和24小时的DgbHLH2基因相对表达水平对照组为常温生长(25℃/22℃ 日/夜CK)。数据采用单因素ANOVA和Tukey检验分析(均值 ± SDn 3)。不同字母表示在p ≤ 0.05具有显著差异。(f) LUC活性定量分析使用t检验(P 0.05)。数据以均值 ± SD表示(n 3)。结论2——DgbHLH2 在低温应激下增强 ROS 清除并维持膜完整性紧接着作者为研究DgbHLH2在菊花中调控ROS含量的功能构建转基因菊花材料——过表达与干扰株系通过NBT和DAB染色图2d、e评估ROSH₂O₂和O₂⁻的积累情况OE染色最深Ri株系染色较浅且定量分析结果与染色情况一致图2-f、g为了弄清DgbHLH2在低温下减少ROS的机制作者测定了SOD、CAT、GST和POD的活性结果显示SOD和CAT活性在WT和转基因系之间没有显著差异图2i、j而POD和GST活性差异明显OE系最高Ri系最低相比WT图2h、k。对于低温下的质膜完整性MDA含量和电解质渗透率REC在OE系最低其次是WTRi系最高图2l、m。以上这些结果表明过表达 DgbHLH2 增强菊花耐寒沉默则耐寒下降该基因通过提升 GST、POD 活性清除 ROS减少细胞膜氧化损伤。图2(a) 在白天温度25℃和夜间温度22℃条件下WT、OE和RNAi株系中DgbHLH2的表达水平。 (b) 不同转基因株系和WT株系的存活率先在6℃培养箱处理然后在25℃低温下恢复生长6小时共15天重复3次每次重复27株植物。 (c) 菊花在低温胁迫下的表型变化。 (d-m) 在4℃处理下不同时间点WT和转基因株系生理指标的测定(d) NBT染色(e) DAB染色(f) O2含量(g) H2O2含量(h) POD活性(i) SOD活性(j) CAT活性(k) GST活性(l) 相对电导率REC(m) MDA含量。差异显著 p 0.05。数据采用单因素方差分析和Tukey检验分析平均值 ± SDn 3。不同字母表示在p ≤ 0.05水平上存在显著差异。结论3——转录组数据证明 DgbHLH2 广泛调控低温、抗氧化、MAPK 通路关键基因DgGST 是核心差异靶基因· 作者将 OE-6、7OE、Ri-1、8、9Ri和野生型植物WT置于 4℃ 下处理 6 小时随后进行了 RNA-seq 分析。RNA-seq 分析显示OE vs WT 有 213 个上调基因Ri vs WT 有 2804 个下调基因OE 和 Ri 组之间有 1922 个差异表达基因DEGs图 3a、c、d。根据韦恩图分析有 21 个基因在三组比较中共同调控OE vs Ri、Ri vs WT 和 OE vs WT图 3b。GO/KEGG 富集结果显示差异基因富集氧化还原酶活性、MAPK 植物信号通路、苯丙烷生物合成、脂肪酸代谢、ABA 响应通路DgbHLH2 参与多条低温胁迫调控通路。 图 g-i的 qPCR 验证表明DgGST、DgPOD、DgCBF 等耐寒基因在 OE 上调、RNAi 下调与转录组 FPKM 趋势完全吻合其中 DgGST 变化幅度最显著DgGST 是 DgbHLH2 下游关键靶基因。图3转基因和野生型WT株系的RNA-Seq分析。(a、c 和 d) OE 与 Ri (a)、OE 与 WT (c)、以及 Ri 与 WT (d) 的基因表达变化火山图。(b) Venn 图。OE 与 Ri (绿色)、Ri 与 WT (蓝色)、OE 与 WT (红色) 组间存在差异的基因。(e) 参与冷胁迫的43个关键差异基因的聚类热图。(f) 转基因与 WT 株系的差异表达基因(DEGs)聚类热图。(g-i) DgGST (Cse_sc032588.1_g020.1) (g)、DgPOD (Cse_sc000910.1_g010.1) (h)、DgCBF (Cse_sc001867.1_g010.1) (i) 在 0、3、6、12 和 24 小时在 4℃ 下的基因组浏览器轨迹和 qRT-PCR 分析。采用方差分析ANOVA和 Tukey 测试均值 ± SD, n 3。不同字母表示 p ≤ 0.05 时有显著差异。结论4——酵母TF Centered Y1H、Dual-LUC、EMSA、ChIP-qPCR 证明 DgbHLH2 蛋白特异性结合 DgGST 启动子 TGAC 顺式元件。酵母TF Centered Y1H 实验结果显示DgbHLH2 可结合 6 种顺式元件其中 WRKY71OSTGAC为已有胁迫研究报道的功能元件结合基因组与转录组筛选出靶基因 DgGST图4、表1。先前研究表明该基序存在于涉及各种防御反应和生长调控过程的基因启动子中因此作者最终选择了 WRKY71OSTGAC基序。对菊花基因组的扫描预测了可能含有该基序并能够结合 DgbHLH2 的潜在启动子该基序出现在 52 个转录因子、98 个激酶和 105 个抗性基因中表 1。将这些候选基因与转录组数据整合后选取了关键基因用于热图构建图 4c。Dual-LUC 、EMSA、ChIP-qPCR 实验均证明 DgbHLH2 蛋白特异性结合 DgGST 启动子 TGAC 顺式元件这一结论图5、6。图4(a) 背景筛查。(b) Y1H 实验使用 SD/-TL、SD/-TLH 和 SD/-TLH 40mM 3-AT 平板。pGAD53m pHIS-p53阳性对照和 pGADT7-bHLH2 pHIS-p53阴性对照。(c) 热图从菊花基因组中筛选出启动子中含有 WRKY71OSTGAC基序的基因并结合转录组数据进行了联合分析。表1DgbHLH2 的靶基因识别图5(a) pBin2 pGreenII 0800-ProDgGST-LUCpBin2-DgbHLH2 pGreenII 0800-ProDgGST-LUCpBin2 pGreenII 0800-LUCpBin2-DgbHLH2 pGreenII 0800-LUC。(b) 不同共表达组合的相对LUC/RLuc活性。(c) 使用突变的DgGST启动子TGAC变为TTAC的双荧光素酶测定pBin2 pGreenII 0800-ProDgGST(突变型)-LUCpBin2-DgbHLH2 pGreenII 0800-ProDgGST(突变型)-LUCpBin2 pGreenII 0800-LUCpBin2-DgbHLH2 pGreenII 0800-LUC。(d) 不同共表达组合的相对LUC/RLuc活性。图6(a) EMSADgbHLH2指目标蛋白ProDgGSTBio代表生物素标记的DgGST启动子探针ProDgGST未标记代表未标记的DgGST启动子探针ProDgGSTBio-突变体代表生物素标记的突变DgGST启动子探针。 (b) ChIP–PCR实验DgGST启动子中的WRKY71OSTGAC基序P1–P3不同的启动子片段其中P2包含TGAC元件。总结低温胁迫诱导 DgbHLH2 表达DgbHLH2 进入细胞核直接结合 DgGST 启动子 TGAC 元件并激活 DgGST 转录DgGST 编码 GST 抗氧化酶提升细胞 ROS 清除能力降低氧化损伤最终增强菊花耐寒性。本篇文章中的“酵母TF Centered Y1H”实验由南京瑞源生物提供。该技术是一种研究DNA与蛋白质之间相互作用的技术通过已知的转录因子蛋白筛选与其存在相互作用的motif并确定该转录因子可能调控的靶基因或鉴定蛋白/DNA 上影响结合的关键位点。