在分子生物学研究中识别和分析基因组范围内的调控元素是理解基因表达调控机制的关键。随着高通量测序技术的不断进步诸如ChIP-seq、ATAC-seq、CUTTag和DAP-seq等技术为我们提供了强大的工具以揭示转录因子结合位点、开放染色质区域和DNA结合蛋白的相互作用等信息。在这些实验数据中我们常常接触到“peak/差异Peak”的概念。从分析逻辑上来说Peak究竟是如何产生的本文将探讨这些问题背后的分析逻辑主要围绕以下四个问题帮助大家更好地理解这些高通量数据的分析结果。Q1: merge peak 和合并组peak是什么计算逻辑以及差异是什么A1: 首先我们来解释下什么是peakpeak峰是指在基因组中发现的特定区域这些区域显示出显著的信号强度通常与转录因子结合或其他蛋白质-DNA相互作用相关。表观组学的研究一般会同组设计2~3个重复MACS2软件图1进行call peak时会基于reads进行建模以及均一化方便IN和IP之间具有可比性随后利用泊松分布计算显著性p值后利用预先设置的显著性阈值输出peak结果文件图1。除了单样本IP VS IN的call peak当组内有生物学重复时MACS也能整合组内重复数据输出“以组为单位的peak结果”图2。除了MACS自身分析的“组peak”外我们还会人为对组内生物学重复peak进行merge peak分析得到以第二种方式分析的“组的peak”分析逻辑如图3。图 1 MACS2分析流程图 2 “合并组peak”的分析逻辑图 3 merge peak示意图Q2: diff peak计算逻辑A2:差异peak就是要涉及到组间比较了通常使用的分析软件是DiffBind分析包。该软件会对两个不同组样品进行差异分析计算peaks重复间隔的测序reads数并基于结合亲和力鉴定具有统计显著性的差异结合位点确定样品间上调或下调差异修饰的区间。分析思路采用了RNA-seq中差异基因表达的方式来进行peak的差异分析和macs2的差异功能bdgdiff不同DiffBind需要依赖已有的peak calling结果将peak区域当做RNA-seq中的基因区域然后对这些区域进行定量和差异分析其核心的差异分析通过调用RNA-seq中常用的R包来实现。通常默认的模型是DESeq2。这就意味着如果要用DiffBind进行差异分析的话必须要有重复样本否则行不通。除了直接使用DiffBind软件计算组间差异还可以顺着merge peak的位置信息通过取交集的方式分析两组样本间的差异。Q3: diff peak的结果文件怎么看Up / down代表什么?A3: Diff_anotation注释表格图4是整个差异组比较中最核心的部分:“Treat_vs_CK.merge_peak_down.peak_annotation”是利用组内重复merge取交集后的peak再按照peak位置关系做组间比较得到Treat与CK相比较只在CK中有富集的峰“Treat_vs_CK.merge_peak_up.peak_annotation”是利用组内重复merge取交集后的peak再按照peak位置关系做组间比较得到Treat与CK相比较只在Treat中有富集的峰以上merge之间peak的比较只有有无的区别没有显著性的统计学计算。“Treat_vs_CK.down.peak_annotation”是利用DiffBind软件默认是内置DESeq2逻辑分析组间peak差异与merge_peak分析不同该软件包会进行统计学显著性的计算并对富集倍率有一定要求默认阈值为FDR值小于0.05并且Foldlog2FC小于0。分析结果包含Fold、p.value、FDR、关联靶基因等如图5。down是指Treat与CK相比较在Treat中富集倍率降低的peak区域。“Treat_vs_CK.up.peak_annotation”同样也是利用DiffBind软件分析的是指Treat与CK相比较在Treat中富集倍率升高的peak区域。“Treat_vs_CK.mid”是样本间所有差异的Peak的文件老师们可以利用这个文件结果自主利用阈值筛选“Treat_vs_CK.nofilt”同样也是样本间所有差异的Peak的文件只不过包含了注释信息。两种比较方案有不同的侧重点merge diff侧重于分析A组相对于B组的“特有peak”而diffbind则倾向于分析两组间固定区域的结合强度差异FOLD。因此两个差异方案结合能从不同角度探究组间差异老师可自行按照自身关注点来选择以哪种结果进行后续研究。图 4 Diff_anotation文件图 5 软件分析表格结果Q4: 无重复单样本组间比较和多重复样本组间比较的逻辑差异A4: 对于多重复样本差异分析可以参考上述A3中的DiffBind软件包或者先取组内交集merge再做组间比较而对于单样本的组间比较就没有那么多选择了只能通过peak位置判断差异取两组间非交集的peak区域。上述所有的分析内容在爱基的ChIP-seq、ATAC-seq、CUTTag和DAP-seq项目中都可以分析哦依据分析出来的peak爱基还可以提供指定的基因/peak的reads富集峰图欢迎各位有相关需求的老师前来咨询~ChIP-seq简介爱基百客王牌产品ChIP-seq技术将染色质免疫共沉淀和二代测序技术结合是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具可用于组蛋白修饰、RNA聚合酶、转录因子和辅因子等方面的研究技术成熟稳定。爱基百客ChIP-seq可提供01 ChIP-seq测序分析Peak分析:Peak注释和分布分析Peak关联基因的GO、KEGG的注释和富集分析转录因子和Motif分析等。多样本差异分析差异Peak分布情况统计差异Peak关联基因GO、KEGG功能注释与富集转录因子预测Motif预测等。02 后续验证· ChIP-qPCR分析组蛋白修饰/转录因子与染色质区域的结合情况揭示染色质状态和基因表达调控之间的关系真实反映结合特性。· EMSA基于DNA-蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE中的迁移率不同检测活化的与DNA结合的蛋白转录或调节因子。· 双荧光素酶报告实验检测转录因子与靶启动子的特异结合。03 ChIP-seq转录组关联分析ChIP-seq和转录组关联分析可以做以下2个方面的研究· DNA结合蛋白和基因表达调控通过ChIP-seq技术可以确定DNA结合蛋白如转录因子的结合位点然后与转录组数据结合分析可以获得转录因子直接调控的靶基因为全面理解转录因子调控功能提供依据。· 组蛋白修饰和基因表达ChIP-seq可以用于鉴定组蛋白修饰的位点结合转录组数据可以了解这些修饰对基因表达的影响。04爱基百客ChIP-seq三大优势· 优势一项目经验丰富研究物种200种累计实验2000余次。全面覆盖医口和农口等不同样本不惧特殊样本如脂肪组织、高淀粉组织和真菌类抗体经验也极其丰富多种组蛋白修饰、转录因子、标签抗体以及p300和RNApol II等均有涉及· 优势二提供前期实验设计、测序、分析以及后期验证ChIP-qPCR、EMSA一站式服务· 优势三项目文章多次发表于Science、Cancer Cell、Nature Plants、Nature Metabolism以及Plant Cell等期刊。参考文献Zhang, Y., Liu, T., Meyer, C. A., Eeckhoute, J., Johnson, D. S., Bernstein, B. E., Nusbaum, C., Myers, R. M., Brown, M., Li, W., Liu, X. S. (2008). Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome biology, 9(9), R137. https://doi.org/10.1186/gb-2008-9-9-r137Stark, R., Brown, G. (2011). DiffBind: differential binding analysis of ChIP-Seq peak data. R package version, 100, 4-3