近日华中师范大学徐旭东团队与中科院分子植物科学卓越创新中心张余团队的合作成果论文“Coordination of N2-fixing cell specialization and patterning in filamentous cyanobacteria by a uniquely structured σ factor”发表在《PNAS》。该研究公布了异形胞分化的核心调控回路、整体网络框架并确认核心调控因子HetZ是一种具有特殊结构和作用机理的sigma因子称为σHetZ。爱基百客为该研究提供ChIP-seq的技术支持。研究背景在自然界中包括鱼腥藻Anabaenasp. PCC 7120在内的许多丝状蓝藻能够分化出专门用于固氮的异形胞这些细胞与进行产氧光合作用的营养细胞在丝状体中以半规则的图灵样模式间隔排列从而为对氧气极度敏感的固氮酶提供微氧环境。异形胞分化的分子调控研究已鉴定出多个关键因子HetR作为主控调节因子受氮缺乏信号经NtcA介导的诱导并直接调控下游基因表达PatS和PatX则产生可扩散的RGSGR类小肽抑制剂通过抑制HetR活性来介导细胞间的侧向抑制从而决定异形胞的空间分布模式。这些核心调控环节之间存在关键缺环——HetR虽调控hetZ的表达却不直接结合patS、hetR、ntcA等关键基因的启动子表明存在未被鉴定的中间因子。同时HetZ与PatU3虽已知参与分化但其蛋白特性、直接靶标以及整体机制均有待进一步阐明。因此揭示HetZ的分子身份及其作为核心调控节点的作用完整构建异形胞分化的基因调控网络是理解这一多细胞分化与图灵图式形成机制的关键也为合成生物学改造蓝藻、构建植物内固氮共生体提供理论指导。研究思路作者首先通过ChIP-seq和RNA-seq鉴定出HetZ直接结合并调控hetR、patS、patU5-patU3、ntcA、sigC及hep基因等核心靶标。随后通过AlphaFold2软件预测和大肠杆菌重构转录系统证实HetZ是一种ECF型σ因子能结合RNA聚合酶核心酶直接激活靶基因转录。接着利用重构系统和体内报告株交叉验证绘制出以σHetZ为中心的完整基因调控网络。最后通过冷冻电镜解析σHetZ-RNAP-启动子开放复合物结构并在七重敲除底盘菌株中合成重构最小核心回路。这项研究从体内筛选到体外验证、从遗传分析到结构全面系统的解析异形细胞分化的机制网络。研究结果1HetZσHetZ在异形胞分化中的核心作用首先通过ChIP-seq在全基因组范围鉴定HetZ的直接结合靶标。利用HetZ抗体在野生型和hetZ4-201突变体中进行ChIP-seq分析发现HetZ特异性结合位点显著富集于ntcA、hetR、patS、patU5-patU3、sigC及hep基因簇alr2825-alr2841等启动子区图1A。RNA-seq分析显示hetZ突变体中ntcA、patS、sigC和hep基因均下调。进一步通过PntcA-gfp报告株验证发现ntcA启动子驱动的gfp呈异形胞特异性表达−35区突变或hetZ失活均看到该表达消失在ΔhetR突变体中用铜诱导启动子驱动hetZ表达时PntcA-gfp在异形胞中上调图1B。从546个差异ChIP-seq峰中鉴定出σHetZ识别启动子的保守序列DIF1TCCGGAntcA启动子与此典型序列部分吻合图1C。在ΔhetP突变体中σHetZ蛋白水平升高但ChIP-seq峰消失或大幅减少RNA-seq结果与hetZ突变体相似图1A提示HetP通过增加靶DNA对σHetZ的可及性来增强转录。总体而言这些结果一致表明HetZ即σHetZ直接激活异形胞分化关键基因的表达是调控网络中的中心激活因子。图1 HetZσHetZ直接激活参与异形胞分化与形态构建的基因2大肠杆菌中重构的转录系统验证σHetZ的直接调控作用为了系统阐明鱼腥藻异形胞分化过程中的基因调控网络本研究在大肠杆菌E. coli中成功重构了鱼腥藻的转录系统二/三质粒系统。三质粒系统用于检测σ因子对靶启动子的直接激活结果显示σHetZ直接激活PhetR、PpatS、PpatU5-patU3、PsigC、Palr2830、Palr2833和PhepA−35区突变或引入功能受损的hetZ突变体显著降低这些启动子的gfp表达。三质粒系统的有效性在二质粒系统中得到了验证。同时鱼腥藻体内实验也有类似的发现。这充分证明了σHetZ是异形胞分化网络中的核心激活因子。而共表达PatU3则抑制上述激活证实了PatU3与σHetZ的拮抗调控关系图3A。研究还发现鱼腥藻中存在σHetZ的同源物σHetZ′由alr0202编码。在大肠杆菌系统中的测试表明σHetZ′具有与σHetZ几乎完全相同的功能活性且同样受到PatU3的拮抗。尽管σHetZ′的内源表达水平较低且具有不同的调控模式但它的功能冗余性解释了单突变体分化表型“渗漏”的原因而ΔhetZ′PpetE-hetZ双突变体在无铜缺氮条件下则完全丧失了分化能力。此外本研究利用大肠杆菌系统发现σC激活PhetZ、PsigE、Palr2830σE激活PhetZ、PsigC、Palr2830、PhglD、PcnfR图3B三者构成“3σ”互调控回路。这一环路的发现解释了核心激活因子σHetZ如何通过σC和σE间接控制固氮酶和异形胞包被糖脂的合成。同时主调控因子HetR的测试表明HetR能够不依赖于蓝藻特异性σ因子可能利用大肠杆菌内源σ因子直接结合并激活PhetZ和PhetP。上述体内外研究共同勾勒出了以σHetZ为枢纽、多因子协同反馈的异形胞分化基因调控网络het-GRN。图2 het-GRN网络的重建图3大肠杆菌搭载鱼腥藻转录系统的GFP荧光显微照片显示het-GRN中的调控关系。3最小核心回路足以启动异形胞分化并可被PatS规范空间模式为验证CRC在细胞分化和模式启动中的充分性首先构建了七重敲除突变体ΔhetRΔhetZΔpatU5-patU3ΔhetPΔpatSΔpatAΔhgl作为完全丧失分化能力的“空白底盘”。在此底盘上导入由hetR和hetZ-patU5-patU3位于RSF1010质粒及染色体patX组成的最小核心回路mini-CRC编码HetR-PatX和σHetZ-PatU3两对激活-抑制因子图4A-I。在缺氮条件下携带mini-CRC的七重缺失突变体产生多个连续增大的细胞其中hetR和hetZ-patU5-patU3均上调这些细胞为正在分化但缺乏糖脂层的异形胞前体图4A-II。将hetZ启动子上的HetR结合位点突变切断HetR→σHetZ的连接则分化完全消失图4A-III。在mini-CRC基础上额外加入patS后图4B-I分化细胞的增大受到抑制且连续分化细胞的数量显著减少图4B-II同样HetR结合位点突变也使含patS的系统完全丧失分化能力图4B-III。总体而言这些结果表明HetR-PatX↔σHetZ-PatU两对激活-抑制因子是启动异形胞分化的充分且必要条件而PatS作为抑制因子的作用是进一步精修图式。图4 基于mini-CRC模式的细胞分化4冷冻电镜结构揭示了σHetZ-RNAP-启动子开放复合物的独特构象为从结构层面确立σHetZ作为σ因子的分子基础首先通过凝胶过滤层析证实σHetZ与RNAP核心酶共洗脱形成全酶体外转录实验证实σHetZ-RNAP特异性转录PpatS但不识别σA型启动子T5-N25。随后以2.88 Å分辨率解析了σHetZ-RNAP-启动子DNA开放复合物σHetZ-RPo的冷冻电镜结构图5A-C。该结构清晰显示RNAP六个亚基αⅠ、αⅡ、β、β′1、β′2、ω和σHetZ的六个结构域σHetZi1、σHetZ2、σHetZi2、σHetZ3.2、σHetZi3图5B-D并分辨出上游−40至−13和下游3至15双链DNA、转录泡的非模板单链DNA及5-nt RNA引物图5E。σHetZ的σ2和σ4分别结合RNAP β′1的卷曲螺旋和β亚基的襟翼尖端螺旋图5F、H与已知ECF-σ因子类似但σi3结构域与RNAP核心酶β结构域发生额外相互作用这是区别于其他ECF-σ因子的独特特征图5H。σHetZ的σ2结构域还通过σ3.2结构域穿入RNAP活性中心裂缝图5G。该结构从原子水平证实了HetZ作为ECF型σ因子的身份并揭示了其与RNAP核心酶互作的独特模式。图5σHetZ-RPO整体结构5σHetZ利用独特的σi2结构域实现启动子DNA解旋冷冻电镜结构显示σHetZ-RPo中−13位碱基仍保持配对但从−12位开始非模板链已解旋图6A-B表明RNAP-σHetZ全酶在−13/−12交界处启动DNA解旋。σi2结构域的β发夹含I177、L179、L186、L189四个疏水残基突出于该交界处并堆叠在−13核苷酸上阻止上游dsDNA进一步延伸从而稳定解旋上游边界图6B-C。σi2缺失或上述疏水残基突变均严重降低转录活性。这一机制与其他σ70型因子形成鲜明对比——后者利用σ2结构域而非专门的插入结构域来实现启动子解旋图6B。σHetZ的−10元件TGnA由σi1和σi2共同识别G-12nt和T-11nt翻转进入由R57、I58、E61、E147、R175形成的蛋白口袋图6D-ET-13nt和A-10nt分别由R190和R82通过碱基特异性氢键识别图6C、E。−35元件TCCGGA则由σ4结构域的一个螺旋位于dsDNA大沟中识别图6F-GR291、D294、Y295、Q298与−35元件碱基形成特异性相互作用图6G。σ4和σi1还与启动子DNA磷酸骨架发生广泛的非特异性极性相互作用。总体而言这些结构特征揭示了σHetZ识别和解旋启动子DNA的独特分子机制。交联质谱XL-MS分析表明PatU3与σHetZ形成复合物相互作用位点涉及σHetZ的σi1、σi3和σ4三个结构域图5D。这种结合阻止了σHetZ对靶启动子−10和−35区的识别从而抑制σHetZ依赖的转录激活。该结果与E. coli重构系统中PatU3抑制σHetZ活性的表型完全一致图3A从分子互作层面解释了PatU3作为抗σ因子的作用机制。值得注意的是PatU3结合的两个插入结构域σi1和σi3同时也是σHetZ区别于其他ECF-σ因子的独特结构特征提示这些插入结构域在σHetZ的调控中兼具激活识别−10区和抑制结合PatU3的双重功能。图6σHetZ与启动子DNA之间的相互作用研究结论本研究通过ChIP-seq在全基因组范围确定了σHetZ的直接靶标RNA-seq揭示了hetZ突变体的转录组变化结合重构转录系统和冷冻电镜结构解析首次确立了σHetZ作为异形胞分化基因调控网络的中心激活因子揭示了其独特的结构-功能关系定义了由两对激活-抑制因子构成的最小核心回路并完整构建了从细胞命运决定到形态建成和固氮功能的基因调控网络将σ因子的功能从传统的转录起始拓展到了多细胞图灵图式形成的层面。